Электрохимические ДНК-сенсоры для определения биологически активных низкомолекулярных соединений
←
→
Транскрипция содержимого страницы
Если ваш браузер не отображает страницу правильно, пожалуйста, читайте содержимое страницы ниже
Г. А. Евтюгин, Г. К. Будников, А. В. Порфирьева
УДК 543.64
Электрохимические ДНК-сенсоры для определения
биологически активных низкомолекулярных соединений
Г. А. Евтюгин, Г. К. Будников, А. В. Порфирьева
ГЕННАДИЙ АРТУРОВИЧ ЕВТЮГИН — доктор химических наук, профессор кафедры аналитической химии
Казанского государственного университета. Область научных интересов: биоэлектрохимические методы
анализа. E-mail Gennady.Evtugyn@ksu.ru
ГЕРМАН КОНСТАНТИНОВИЧ БУДНИКОВ — доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой
аналитической химии Казанского государственного университета. Область научных интересов: электрохи-
мические методы анализа, химические и биохимические сенсоры. E-mail Herman.Budnikov@ksu.ru
АННА ВЕНИАМИНОВНА ПОРФИРЬЕВА — аспирант кафедры аналитической химии Казанского государ-
ственного университета. Область научных интересов: электрохимические и пьезометрические ДНК-
сенсоры. E-mail porfireva-a@inbox.ru
420008 Казань, ул. Кремлевская, 18, Химический институт им. А.М. Бутлерова Казанского государственного
университета им. В.И. Ульянова-Ленина, тел. 843-231-54-91.
Введение ментарными участками олигонуклеотидов пробы. Про-
Развитие методов биоанализа, использующих в каче- исходит связывание нуклеотидов в устойчивые пары
стве элементов молекулярного распознавания нуклеи- аденин-тимин и гуанин-цитозин с образованием спи-
новые кислоты, синтетические и природные олигонук- ральной двунитевой ДНК — так называемый процесс
леотиды, — одно из актуальных направлений современ- гибридизации. Такие взаимодействия отличаются высо-
ной аналитической химии [1]. В рамках создания новых кой специфичностью. Они позволяют регистрировать не
методов биоанализа большое внимание уделяется про- только комплементарное связывание, но и влияние на
цессам взаимодействия ДНК с высоко- и низкомолеку- него различных факторов [8]. В массивах ДНК-чипов в
лярными соединениями природного и антропогенного качестве сигнала часто регистрируется индуцируемая
происхождения, что объясняется несколькими причи- лазерным лучом флуоресценция, что позволяет добить-
нами. Прежде всего это необходимо для решения широ- ся высокой производительности и чувствительности
кого круга биомедицинских проблем, связанных с онко- измерения (обнаружение до десятков тысяч нуклеотид-
логическими и аутоиммунными заболеваниями, а также ных последовательностей на каждый сенсор) [4]. Суще-
для решения задач генетической диагностики [2]. Био- ствуют также упрощенные электрохимические ДНК-
сенсорные технологии позволяют устанавливать после- сенсоры с меньшим числом ДНК-зондов, в том числе
довательность нуклеотидов специфических участков комплектуемые специализированными измерительными
ДНК, что актуально для идентификации патогенных блоками [7].
микроорганизмов и вирусов, установления отцовства, Несмотря на успехи, достигнутые в решении про-
при изучении полиморфизма генов, для раннего обна- блемы обнаружения комплементарных последователь-
ружения врожденных генетических аномалий [3]. Раз- ностей олигонуклеотидов и расшифровки таких после-
витие биосенсорных технологий сыграло решающую довательностей с помощью специфических зондов,
роль в научно-методическом и технологическом обес- остается область задач, где преимущества ДНК-
печении расшифровки генома человека [4]. сенсоров пока не реализованы в полной мере. Речь идет
Высокая потребность в ДНК-сенсорах, значительные об определении низкомолекулярных соединений, взаи-
финансовые вливания позволили ускорить их коммер- модействующих с нуклеиновыми кислотами. Эта анали-
циализацию, в том числе с созданием специализирован- тическая функция ДНК-сенсоров имеет важное практи-
ных венчурных компаний [5—7]. В так называемых ческое значение. Специфические взаимодействия низ-
ДНК-чипах детектируется взаимодействие короткоце- комолекулярных соединений с ДНК определяют дейст-
почечного олигонуклеотида (ДНК-зонда), закрепленно- вие лекарственных противораковых препаратов, по-
го на поверхности преобразователя сигнала, с компле- следствия окислительного и термического шока, про-
66Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2008, т. LII, № 2
цессы повреждения и эффективность репарации нук- ионов металлов [19]. Однако их недостаточно для по-
леиновых кислот [13-15]. ДНК-сенсоры могут служить нимания того, как механизмы взаимодействия ДНК с
удобными моделями для изучения процессов in vitro в соответствующими компонентами реализуются в тех
таких областях, как фармакология, экотоксикология и или иных электрохимических приложениях, как реали-
экологическое нормирование содержания токсикантов в зовать преимущества электроанализа в качестве удобно-
окружающей среде. Несмотря на то, что условия взаи- го инструментария, обеспечивающего не только пони-
модействия нуклеиновых кислот с низкомолекулярными мание природы интермедиатов, но и в определенной
регуляторами и эффекторами различной природы отли- степени механизма их образования. В данном обзоре
чаются от таковых в живой клетке, с помощью ДНК- рассмотрены электроаналитические аспекты генериро-
сенсоров можно оценивать специфичность связывания, вания сигнала ДНК-сенсоров и определения с их помо-
механизм регуляторного или повреждающего действия щью низкомолекулярных соединений.
и трансформации биологически активных веществ в
Определение лекарственных препаратов
биохимических реакциях с участием ДНК. Важной за-
дачей является определение эффективных лекарствен- Как отмечалось выше, ДНК являются основной био-
ных доз противораковых препаратов, отличающихся логической мишенью для широкой группы лекарствен-
высокой токсичностью, а также их концентраций в био- ных препаратов, прежде всего противоопухолевого
логических жидкостях и товарных формах. ДНК- действия. По химической природе препараты, приме-
сенсоры перспективны для скрининга и исследования няемые в современной клинической практике, можно
фармакокинетики новых лекарств и биологически ак- разделить на следующие группы: комплексные соеди-
тивных пищевых добавок [16]. нения металлов — платины, рения, осмия, кобальта,
Возможности генерации аналитического сигнала, никеля и ряда других; антрациклиновые препараты;
обусловленного взаимодействием ДНК с низкомолеку- растительные алкалоиды.
лярными соединениями, весьма разнообразны. С одной Их действие на ДНК обусловлено контролем про-
стороны, это может обеспечить специфичность опреде- цессов транскрипции и активности полимераз (в этом
ления, а с другой — создает некоторые трудности для случае лекарственный препарат реагирует с белками,
исследователя, который вынужден адаптировать конст- связывающимися с ДНК); влиянием на реакции ДНК с
рукцию биосенсора и протокол измерения для каждого РНК, в том числе на образование гибридных спиралей
нового объекта анализа. Вероятно, по этой причине ДНК-РНК и триплексов двунитевой ДНК и РНК; пря-
сверхпроизводительные флуоресцентные методы изме- мым взаимодействием — интеркалированием — со
рения с использованием ДНК-чипов для определения спиралью ДНК. В последнем случае плоская ароматиче-
низкомолекулярных соединений не применяются. Их ская молекула или ее фрагмент встраивается между
производительность и универсальность заведомо избы- парами комплементарных нуклеиновых оснований спи-
точны для анализа ограниченного числа проб, а высокая рали ДНК. Поскольку интеркалирование возможно
стоимость их изготовления резко увеличивает себе- только с двунитевой ДНК, интеркаляторы являются
стоимость разового измерения сигнала. Для практики также маркерами процесса гибридизации с участием
определения низкомолекулярных соединений рацио- ДНК-зонда: сигнал, обусловленный их электрохимиче-
нально применение небольших и относительно недоро- ским окислением, меняется в зависимости от того, про-
гих устройств на основе единичных ДНК-сенсоров или изошла ли гибридизация или интеркалирование или
небольших их массивов (десятков сенсоров, изготавли- электрод покрыт только однонитевым ДНК-зондом.
ваемых методами фотолитографии на единой подлож- Антрациклиновые препараты
ке), ориентированных на анализ десятков и сотен проб в
течение рабочего дня. В таком формате анализа опреде- Ниже приведены структуры некоторых антрацикли-
ленные преимущества перед флуоресцентными и масс- новых соединений, используемых в ДНК-сенсорах для
селективными сенсорами имеют электрохимические регистрации гибридизации, а также определяемых по
принципы регистрации сигнала. Электрохимические взаимодействию с ДНК.
ДНК-сенсоры более простые в аппаратурном оформле- O
O OH
нии, они менее чувствительны к компонентному составу C CH3
матрицы, имеют более удобный интерфейс управления
основными операционными параметрами. А относи- OH
тельно мягкие требования по интервалу определяемых
концентраций и пределам обнаружения низкомолеку- O
лярных соединений нивелируют различия в чувстви- OCH3 O OH
тельности электрохимических и упомянутых выше O
принципов измерения сигнала. CH3
В последнее время появились обзорные работы, HO
обобщающие опыт по использованию электрохимиче-
H2N
ских ДНК-сенсоров для определения низкомолекуляр-
ных соединений — лекарственных препаратов [17, 18] и Дауномицин
67Г. А. Евтюгин, Г. К. Будников, А. В. Порфирьева
O [20, 21]. В случае дауномицина и адриамицина взаимо-
O OH
C CH2OH действие происходит в основном по парам нуклеотидов
ДНК гуанин-цитозин. В среднем одна молекула интер-
OH калятора приходится на 3—6 комплементарных пар
оснований в зависимости от нуклеотидного состава
O ДНК-зонда. Митоксантрон дает еще более плотную
OCH3 O OH упаковку комплекса — одна молекула интеркалятора на
O 3 пары нуклеотидов [22].
CH3 На циклических вольтамперограммах дауномицина,
окисляемого на стеклоуглеродном электроде, имеются
HO
две сопряженные пары пиков при потенциалах 535...260
H2 N
и –650...–710 мВ (нас.к.э.) [23]. Адриамицину в анало-
Адриамицин гичных условиях соответствуют пары обратимых пиков
H в области потенциалов –600...–800 и 300...800 мВ [24,
N 25]. Как показало сравнение вольтамперограмм деаэри-
OH O HN OH рованного и насыщенного кислородом растворов этих
соединений, пики в катодной области потенциалов от-
носятся к каталитическому восстановлению молекуляр-
ного кислорода. Анодные процессы связаны предполо-
жительно с окислением гидроксильных групп в конден-
сированных ароматических кольцах. рН-зависимость
OH O HN OH
N потенциалов пика свидетельствует об эквивалентном
H переносе двух электронов и двух ионов водорода. Близ-
Митоксантрон кое поведение демонстрируют митоксантрон: три пика
OH окисления в области потенциалов 0,3...0,8 В в режиме
квадратноволновой вольтамперометрии [26], а также
H
(CH 3)2N ногаломицин: анодно-катодный пик кислорода при
–0,520 В и пики окисления самого ногаломицина при
O O O OH COOCH3
менее отрицательных потенциалах (стационарный ртут-
HO CH3 ный электрод, рН = 7,0 [20]).
При добавлении в анализируемый раствор ДНК пики
H 3C OH антрациклиновых препаратов уменьшаются, что свиде-
тельствует об интеркалировании антрациклинов и обра-
зовании электрохимически малоактивного аддукта с
H O
OH O OH ДНК. На угольно-пастовом электроде дауномицин
окисляется при 0,50 В, тогда как в комплексе с нативной
CH 3O O
ДНК — при 0,56 В. При введении ДНК в раствор дау-
CH3 номицина оба пика наблюдаются совместно, при этом
CH 3 пик гуанина, не связанного в комплекс с препаратом,
прогрессирующе снижается, а высота пика аддукта —
CH 3O OCH 3 увеличивается. При иммобилизации ДНК на электроде
Ногаломицин обнаруживается только пик окисления аддукта [27].
Изменения электрохимического поведения антрацикли-
Наиболее изучено электрохимическое поведение нов наблюдаются при введении в раствор или нанесении
адриамицина (другие коммерческие названия — доксо- на поверхность электрода двунитевой нативной ДНК.
рубицин, адриабластин), который наряду с бисфенан- Если использовать однонитевую ДНК, получаемую
тролиновым комплексом меди(II) и метиленовым синим путем термической денатурации, соответствующие пики
является типичным маркером гибридизационных про- меняются незначительно.
цессов с участием ДНК, сорбированной на электроде. Следует отметить, что сорбция антрациклинов на
Все антрациклины интеркалируют частично, по сис- электроде, как и их удерживание в аддукте с ДНК, ад-
теме конденсированных колец, с образованием ком- сорбированной на угольно-пастовом или ртутном элек-
плексов включения с двунитевой ДНК. Прочность свя- троде, настолько сильна, что позволяет проводить элек-
зывания в реакциях с ДНК в растворе закономерно трохимические измерения в два этапа. Сначала произ-
уменьшается в ряду ногаломицин > 4′-оксоадриами- водится накопление препарата в условиях поляризации
цин > адриамицин > дауномицин (измерение со стацио- электрода, затем сенсор переносится в другой раствор и
нарным ртутным электродом). Значения констант свя- регистрируется окисление накопленного аддукта. Такой
зывания, рассчитанные по току окисления антрацикли- прием позволяет повысить эффективность сорбции за
нового препарата, варьируют в интервале (2—4)·105 М–1 счет электростатического накопления и оптимизировать
68Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2008, т. LII, № 2
по рН измерение сигнала. Как правило, пики антрацик- митоксантрона, до 0,2 мМ, высота пиков нуклеотидов
линов лучше выражены при измерении в слабокислых ДНК снижается, а затем увеличивается вплоть до кон-
растворах. Накопление проводят в условиях катодной центрации препарата 0,4 мМ [26]. Сигналы окисления
поляризации при –0,4...–0,7 В. В этой области потен- нуклеотидов появляются и исчезают в течение доста-
циалов генерируются активные формы кислорода, пре- точно длительного периода времени — от 17 ч до 3 сут,
имущественно анион-радикалы. Они окисляют гуанин с что, возможно, связано с медленно протекающими ре-
образованием 8-оксогуанина, регистрируемого по пику акциями окислительной деградации ДНК.
окисления при потенциалах менее положительных, чем Сложность регистрации сигнала антрациклинов и
потенциал окисления гуанина [24]. То же соединение его изменчивость во времени затрудняют использование
(оксогуанин) является маркером окислительного повре- ДНК для количественного определения этих препара-
ждения ДНК в живых организмах. Появление сопря- тов. Литературные источники дают лишь оценки интер-
женных пиков окисления гуанина (8-оксогуанина) наря- вала определяемых концентраций, а именно n·(10–5—
ду с пиками окисления дауномицина или адриамицина 10–6) М. Также трудно сказать что-либо о селективности
свидетельствует о взаимодействии двунитевой ДНК с процесса. Дополнительную информацию о составе объ-
антрациклином, причем восстановленная форма антра- ектов контроля мог бы дать совместный анализ высот
циклинового препарата прочнее связывается с двуните- пиков окисления антрациклинов, гуанина, аденина и
вой ДНК, чем окисленная. Соотношение констант ус- продуктов их окисления. Вместе с тем следует иметь в
тойчивости соответствующих комплексов можно полу- виду, что проявление окислительного действия компо-
чить, исходя из разности стандартных окислительно- нентов раствора (например, кислорода), как и сигнал
восстановительных потенциалов соответствующих ДНК, существенно зависит от условий измерения сигна-
форм антрациклина в присутствии ДНК [20]. ла: рН, времени контакта, условий вольтамперометри-
Электрохимическое окисление антрациклиновых ческого или хронопотенциометрического эксперимента.
препаратов происходит при высоких перенапряжениях. Фенотиазины
Это связано со стерическими ограничениями переноса
электрона, обусловленными присутствием остатков К данной группе лекарственных препаратов относят-
сахаридов вблизи окисляющегося фрагмента молекулы. ся вещества, обладающие бактерицидным и фотосенси-
Кроме того, значительны сопутствующие емкостные и билизирующим действием (тиазиновые красители мети-
сорбционные токи, особенно при измерении на электро- леновый синий, метиленовый зеленый, толуидиновый
дах, покрытых ДНК. Поэтому для регистрации аналити- синий), нейролептики промазин и его аналоги, приме-
ческого сигнала используют наиболее чувствительные няемые для снятия агрессивных состояний у человека и
варианты вольтамперометрии — дифференциальный животных, а также для лечения шизофрении и других
импульсный и квадратноволновой методы, а также ин- психических расстройств.
версионную гальваностатическую хронопотенциомет- N Cl-
рию. В последнем случае электрод поляризуют под дейст-
вием постоянного тока в микроамперном интервале значе- H3 C CH
ний и регистрируют изменение электродного потенциала Е N S N+ 3
во времени t. Электродным реакциям соответствуют сим- CH3 CH3
метричные пики на хронопотенциограммах E — (dt/dE). Метиленовый синий
Площадь, занимаемая этими пиками, пропорциональна
концентрации деполяризатора [28]. N NO 2
Исключение составляет электрохимическое поведе-
ние митоксантрона, сигнал которого синергически уси- H 3C CH3
ливается совместно с сигналом однонитевой (денатури- N S N+
-
рованной) ДНК. Предложен протокол измерения, вклю- CH 3 CH 3 Cl
чающий нанесение на электрод комплекса ДНК- Метиленовый зеленый
митоксантрон, его высушивание и последующее изме-
рение сигнала при помещении электрода в рабочий (H3C)2N S NH2+
буферный раствор. При этом помимо пика тока окисле- Cl -
ния митоксантрона на дифференциальных вольтамперо-
N CH3
граммах появляются пики, отнесенные к гуаниновым
либо адениновым фрагментам ДНК. С двунитевой ДНК Толуидиновый синий
митоксантрон не взаимодействует. Если измерения CH2CH2CH 2N(CH3)2
проводить в растворе, содержащем препарат и однони-
тевую ДНК, без промежуточного высушивания электро- N
да, на вольтамперограммах появляются оба пика окис-
ления гуанина и аденина, возможно, за счет образования
триплексов ДНК (что реализуется аналогично взаимо- S
действию ДНК и РНК). В случае малых концентраций Промазин
69Г. А. Евтюгин, Г. К. Будников, А. В. Порфирьева
N(CH3)2 чив по потенциалу, чем анодный пик, который носит
ярко выраженный сорбционный характер. Взаимодейст-
CH2CH2CH2N(CH3)2 CH2CH вие метиленового синего с ДНК в растворе приводит к
CH3 некоторому снижению сигнала его окисления-вос-
N Cl N
становления и смещению потенциала пика окисления на
10—15 мВ в область более положительных значений
S S [51]. Если краситель реагирует с ДНК, иммобилизован-
Хлоропромазин Прометазин ной на поверхности электрода, то сигнал снижается в
силу интеркалирования метиленового синего в спираль
Все фенотиазины участвуют в обратимых электро- нуклеиновой кислоты.
химических реакциях, сопряженных с процессами пере-
Количественная оценка ассоциации метиленового
носа иона водорода и с другими необратимыми стадия-
синего с одно- и двунитевой ДНК, проведенная по ре-
ми более глубокого окисления. Тиазиновые красители
зультатам кулонометрических и вольтамперометриче-
более устойчивы в окисленной форме, промазины — в
ских измерений, показывает, что прочность связывания
восстановленной форме. Часть фенотиазиновых препа-
маркера с однонитевой ДНК примерно в два раза ниже,
ратов поставляется в виде двойных солей с ионами
чем с двунитевой. Одна молекула метиленового синего
двухвалентных металлов.
приходится в среднем на шесть пар нуклеиновых осно-
При взаимодействии с нативной ДНК фенотиазино-
ваний [30, 34]. Небольшое различие в аффинности ме-
вый фрагмент молекулы включается в состав нуклеино-
тиленового синего по отношению к одно- и двунитевой
вой кислоты, но может реагировать и с однонитевой
ДНК объясняется тем, что помимо интеркалирования по
ДНК по аминогруппам нуклеиновых оснований [29—
парам гуанин-цитозин метиленовый синий способен
33]. В отличие от дауномицина и его аналогов, взаимо-
электростатически взаимодействовать с участками ДНК,
действие фенотиазинов с ДНК не полностью экранирует
богатыми адениновыми фрагментами, располагаясь на
электрохимически активный центр молекулы этих со-
поверхности спирали ДНК [39]. В этом случае образует-
единений, который сохраняет способность к переносу
ся достаточно лабильный комплекс, сохраняющий элек-
электрона. Кроме того, фенотиазины, в отличие от дау-
трохимическую активность.
номицина, благодаря большей гидрофобности могут
встраиваться в самоорганизованные слои ДНК, форми- С аналитической точки зрения имеет значение мо-
руемые на золотых электродах посредством связей Au— дификация электрода однонитевой ДНК, приводящая к
S [34]. увеличению регистрируемых токов окисления/восста-
Фенотиазиновые красители в водной среде окисля- новления маркера на 30—60% (стеклоуглеродный и
ются на электроде с переносом двух электронов и одно- печатный графитовый электроды) по сравнению с про-
го протона и образованием хиноидной структуры: цессами на немодифицированном электроде.
Сродство к ДНК метиленового
H -2e, -H+ синего сохраняет его полимерная
N N
форма, образующаяся в результате
H 3C CH3 H 3C CH3 электрополимеризации, осуществ-
N S N N S N+ ляемой при многократном циклиро-
CH3 CH3 CH3 CH3 вании потенциала электрода в сла-
Для производных промазина предполагается, что в бощелочном растворе мономера
электродной реакции участвует мостиковый атом серы с [40]. Чувствительность к ДНК выражается в изменении
конечным образованием сульфоксида [31]: стационарного потенциала электрода, покрытого поли-
метиленовым синим, при введе-
CH2CH2CH2N(CH3)2 CH 2CH2CH2N(CH3)2 CH2CH2CH2N(CH3)2 нии в раствор нативной ДНК.
Для более точной регистрации
N -2e- N+ +H2O, - 2H+ N сигнала предложен титриметри-
ческий способ, в котором опре-
S S+ S деляют скачок потенциала при
титровании полиметиленового
O синего гидрохиноном. Величина
скачка пропорциональна кон-
Наиболее изучено электрохимическое поведение центрации ДНК в интервале 0,075—2,5 мкг/мл. До-
метиленового синего, маркера гибридизационных про- бавление к нативной ДНК антрациклиновых препаратов,
цессов [34—37]. Его сопряженные пики окисления- конкурентно связывающихся с биополимером, умень-
восстановления на стеклоуглеродном электроде в ки- шает сдвиг потенциала при титровании. Метод позволя-
слой среде симметричны. В случае протекания элек- ет определять 5,0—30 мкг/л доксорубицина при про-
тродной реакции в нейтральной или слабощелочной должительности контакта антрациклина и ДНК 10 мин.
среде катодный пик меньше по величине и более устой- Увеличение продолжительности инкубирования до
70Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2008, т. LII, № 2
30 мин существенно снижает нижнюю границу опреде- 900 мВ (отн. Ag/AgCl). Для сравнения: пик гуанина,
ляемого содержания доксорубицина [41]. постепенно увеличивающийся при контакте электрода с
Метиленовый зеленый в комбинации с ДНК- фенотиазинами, регистрируется при 1100 мВ. В присут-
сенсорами изучен меньше. Он не способен к интеркали- ствии нативной ДНК токи фенотиазинов возрастают.
рованию, однако в окисленной форме электрохимиче- Пределы обнаружения: 5 нМ прометазина, 7 нМ хлоро-
ски взаимодействует с одно- и двунитевой ДНК. Чувст- промазина, 12 нМ незамещенного фенотиазина [45].
вительность определения метиленового зеленого зави- Несколько ниже чувствительность определения проме-
сит от плотности отрицательного заряда биополимера. тазина и хлоропромазина на золотых электродах, со-
При измерении на планарном золотом электроде пока- держащих ДНК, которая ковалентно связана с наноча-
зано, что соответствующие токи и наклоны концентра- стицами золота, удерживаемыми на электроде цистами-
ционных зависимостей для этого красителя закономер- новыми мостиками. Нанесение наночастиц золота по-
но возрастают при переходе от нативной к однонитевой зволяет увеличить рабочую поверхность электрода по
ДНК [42]. Включение ДНК в состав поверхностного сравнению с чистым золотым электродом той же гео-
слоя сенсора увеличивает максимальный ток окисления метрической поверхности, но не интервал определяе-
метиленового зеленого в 10 раз, а наклон концентраци- мых концентраций фенотиазинов, сигнал которых уве-
онной зависимости сигнала — в 14 раз по сравнению с личивается в присутствии ДНК. Ток пика окисления
результатом измерения на чистом золотом электроде. пропорционален концентрации хлоропромазина в ин-
Интересный подход к определению фенотиазинов тервале 1,0·10–5—1,2·10–4 М, прометазина — в интерва-
предложен в [43]. На поверхности электрода иммобили- ле 2·10–5—1,6·10–4 М [46].
зуют нативную ДНК и пероксидазу путем их электро- Попытки применения пероксидазы для повышения
статической сорбции и последующей кросс-сшивки чувствительности определения промазина в комплексе с
глутаровым альдегидом [44]. ДНК играет роль специ- ДНК оказались неудачными, поскольку промазин как
фического сорбента, увеличивая поверхностную кон- субстрат пероксидазы малоактивен [47]. Поэтому для
центрацию фенотиазина, а пероксидаза катализирует его его определения с помощью ДНК-пероксидазного сен-
окисление пероксидом водорода: сора предложено вводить в раствор метиленовый синий
в качестве дополнительного медиатора
электронного переноса. Сигналом слу-
H2O2 , пероксидаза жит ток восстановления окисленной
H формы медиатора, пропорциональный
N N
концентрации промазина в интервале
CH3 CH3
H3C H3C 5·10–5—3·10–4 М, если на поверхности
+
N S N N S N электрода находится двунитевая ДНК, и
CH3 CH3 2·10–5—2·10–4 М в присутствии денату-
MBRed CH3 MBOx CH3 рированной ДНК.
Электрод Сульфаниламиды
В отличие от антрациклинов и фено-
Скорость пероксидазной реакции определяют по тиазинов данная группа лекарств специ-
току восстановления окисленной формы маркера MBOx. фически с ДНК не связывается. Тем не менее по данным
При этом на электроде регенерируется восстановленная энтальпиеметрических измерений сульфаниламиды
форма МBRed, которая, обладая высоким сродством к взаимодействуют с нативной ДНК предположительно
ДНК, вновь вовлекается в каталитический цикл. В ре- по малым бороздкам спирали, влияя тем самым на тем-
зультате достигается высокая чувствительность ДНК- пературу плавления и тепловой эффект термической
пероксидазного сенсора к фенотиазиновым красителям денатурации ДНК. Это позволило предложить косвен-
— субстратам пероксидазы. ДНК-пероксидазный сенсор ные способы определения сульфаниламидов, основан-
позволяет определять 0,02—23 мкМ метиленового си- ные на конкурентных взаимодействиях электрохимиче-
него (Cмин=0,01 мкМ) и 3—120 мкМ метиленового зеле- ски активных маркеров и сульфаниламидов с компонен-
ного (Cмин =0,01 мкМ). Для сравнения: в тех же услови- тами поверхностного слоя ДНК-пероксидазного сенсо-
ях пероксидазный сенсор, не содержащий в своем со- ра. Если сульфаниламиды вытесняют фенотиазиновые
ставе ДНК, определяет 0,08—10 мкМ метиленового маркеры с поверхности ДНК, скорость их ферментатив-
синего, предел обнаружения 0,04 мкМ. ного окисления снижается. Если вытеснение происходит
Промазин и его аналоги сохраняют способность к из спирали ДНК (переход маркера из интеркалирован-
окислению после интеркалирования и включения в ком- ного в свободное состояние), скорость реакции увели-
плекс с двунитевой ДНК. В режиме инверсионной галь- чивается. Соответственно этому меняется ток, характе-
ваностатической хронопотенциометрии на угольно- ризующий скорость пероксидазной реакции. Поэтому
пастовых и толстопленочных планарных графитовых сигнал такого сенсора меняется разнонаправленно, в
электродах они дают пики окисления в области 600— зависимости от природы маркера и условий измерения.
71Г. А. Евтюгин, Г. К. Будников, А. В. Порфирьева
1,2 1,2
SDZ
a б
SMZ
0,8 SMX 0.4 мкМ
SG 0,8
∆i, мкА
∆i, мкА
4 мкМ
0,4 10 мкМ
0,4
ST 1 мкМ
0,0
10–3 10–2 10–1 100 101 0,0
10–3 10–2 10–1 100 101
С, нМ
С, нМ
Концентрационная зависимость выходного сигнала ДНК-пероксидазного сенсора при определении сульфаниламидов
с использованием маркера:
а — влияние природы сульфаниламида на сигнал маркера (0,4 мкМ метиленовый синий); б — влияние концентрации маркера
(0,4—10 мкМ) на сигнал при определении сульфаметоксазола. SMX — сульфаметоксазол, SDZ — сульфадиазин, SMZ — суль-
фаметазин, SG — сульфагуанидин, ST — сульфатиазол
Если в качестве маркера использовать метиленовый вуют конденсированные ароматические, а также другие
синий в области его малых концентраций (0,4 мкМ), планарные фрагменты, облегчающие интеркалирование
присутствие сульфаниламидов приводит к прогресси- их в молекулу ДНК.
рующему снижению сигнала [43, 48]. Ток маркера, регист-
рируемый методом квадратноволновой вольтамперомет- (CH3)2N
рии, зависит от концентрации сульфаниламидов в доста- OH
точно широком интервале их концентраций (см. рисунок).
Увеличение концентрации маркера снижает чувствитель- H C C CH3
ность определения сульфаниламидов, что характерно для
конкурентных методов кинетического анализа. H
Увеличение продолжительности контакта ДНК-
пероксидазного сенсора с сульфаниламидами с 10 до O
30 мин вызывает инверсию влияния сульфаниламидов: Мифепристон
вместо ингибирования ферментативной реакции наблю-
дается рост сигнала сенсора за счет медленного вытес- OCH3
нения из ДНК интеркалированной формы маркера. H3 C O O N N OH
Предложенный способ позволяет определять 0,01—
0,1 нМ сульфаметоксазола, 0,4—20 нМ сульфатиазола, N
0,1—10 нМ сульфадиазина, 0,15—15 нМ сульфаметази- N
на и 0,1—10 нМ сульфагуанидина. Селективность опре- O OCH3 OH
деления в силу неспецифического связывания сульфа-
Келлин Люмазин
ниламидов с ДНК невелика. Можно говорить лишь о
CH3
суммарном определении препаратов при их совместном O
присутствии. O
Метиленовый зеленый связывается с ДНК значитель- N N CH O
но слабее метиленового синего. Соответственно, его ис- N
пользование в качестве маркера ДНК-пероксидазного H3C
сенсора позволяет определять значительно большие кон- HN OCH3
центрации препаратов: 0,5—5,0 мкМ сульфаметоксазола, H3C OH
0,5—6,0 мкМ сульфатиазола, 4—20 мкМ сульфадиазина, O OH OCOCH3
1,1—20 мкМ сульфагуанидина.
OH
Другие фармацевтические препараты
CH3 CH3
ДНК-сенсоры использовали для определения лекар-
ственных препаратов, в молекулах которых присутст- Рифампицин
72Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2008, т. LII, № 2
O OH O
N O
O N
O O
O N O N
O NH
NH S NH
HO O
N S N
HO O HN O
NH O
COOH
O N
HO O O
Байкалин Митомицин C
O
N NH3 Cl
N NH2+
Pt
O2N CH3 Pt 2Cl-
NH NH3 Cl
OH NH2+ H2O
O
NH
Метронидазол Индирубин Цисплатин Хлордиэтилентриамино-
платина(II)
Влияние ДНК на электрохимические характеристики ной вольтамперометрии, пропорционален концентрации
указанных препаратов в целом подобно наблюдаемому препарата в интервале 0,05—0,1 мкМ [52]. Такой же прием
при изучении антрациклиновых препаратов. На элек- накопления на стационарном ртутном электроде, модифи-
троде ДНК-сенсора происходит сорбционное накопле- цированном нативной ДНК, с последующим окислением
ние определяемого соединения, что приводит к измене- электрохимически активного препарата использовали для
нию характеристических сигналов нуклеотидов ДНК. определения антибиотика эхиномицина [53]. Митомицин С
Обычно практикуется сорбционное накопление препа- в тех же условиях ингибирует электрохимическое окисле-
ратов в бестоковом режиме или при постоянной поляри- ние самой ДНК. Пик гуанина, регистрируемый методом
зации электрода с иммобилизованной ДНК. Затем био- дифференциальной импульсной вольтамперометрии или
сенсор переносят в другую среду, более благоприятную инверсионной гальваностатической хронопотенциометрии,
для измерения сигнала. Относительное изменение сиг- закономерно снижается в интервале концентраций препа-
нала зависит как от прочности связывания ДНК с опре- рата 0,1—5,0 мг/л [54].
деляемым соединением, так и от вторичных реакций С помощью ДНК-сенсора можно определять также
ДНК с интеркалированными препаратами. В зависимо- противораковые препараты на основе комплексов пла-
сти от задачи исследования количественные оценки тины — цисплатина и хлордиэтилентриаминоплати-
проводят по пикам окисления ДНК и по собственным ны(II) [55]. Образующиеся аддукты с ДНК окисляются
пикам окисления лекарственных веществ. на электроде в 80 раз медленнее, чем свободная ДНК,
Флавоноид байкалин, выделенный из Scutellaria что выражается в уменьшении высоты пиков окисления
Baicalensis Georgi и проявляющий широкий спектр гуанина, регистрируемых с помощью дифференциаль-
биологической активности (торможение репликации ной импульсной вольтамперометрии. Метод позволяет
ВИЧ, противораковое, антимикробное, иммуномодули- определять субмикромолярные концентрации фарма-
рующее действие), реагирует с одно- и двухнитевой цевтических препаратов.
ДНК, при этом пик его окисления при 0,30 В (нас.к.э.) Мифепристон, синтетический рецептор прогестеро-
уменьшается [49]. Аналогично ведет себя растительный на, взаимодействует только с двунитевой ДНК, адсор-
алкалоид индирубин [50], а также люмазин [51]. В при- бированной на угольно-пастовом электроде. Это выра-
сутствии ДНК происходит закономерное смещение жается в значительном увеличении высоты пика окис-
потенциала и пика окисления препаратов, регистрируе- ления препарата при 0,62 В (нас.к.э.) (вторая гармоника
мое методом дифференциальной импульсной вольтам- переменнотоковой вольтамперограммы). Высота пика
перометрии. Сигнал может быть использован как для пропорциональна концентрации препарата в интервале
определения микромолярных количеств препаратов, так 0,2—2,0 мкМ (Cмин =0,1 мкМ) [56]. Таким же образом
и для оценки содержания нативной ДНК в растворе или ведет себя противомалярийный препарат хлороквин,
на поверхности электрода. сигнал окисления которого при 0,7 В после накопления
Угольно-пастовый электрод, модифицированный на электроде с ДНК возрастает в 10 раз. Аккумуляцию
нативной ДНК, использовали для сорбционного концен- препарата проводили при рН = 4,0 (ацетатный буфер-
трирования келлина, применяемого при лечении ряда ный раствор), измерение сигнала — при рН = 8,0 (фос-
кожных заболеваний. Пик анодного окисления келлина, фатный буферный раствор). Интервал определяемых
регистрируемый методом дифференциальной импульс- концентраций 0,1—10 мкМ [57].
73Г. А. Евтюгин, Г. К. Будников, А. В. Порфирьева
Еще более высокая чувствительность определения Неблагоприятное действие на ДНК химических и
достигается по отношению к рифампицину, противоту- физических факторов может сводиться к повреждению
беркулезному препарату, при измерении на электродах, пространственной структуры ДНК в результате наруше-
покрытых одно- и двунитевой ДНК. Накопление препа- ния комплементарности связывания пар оснований
рата приводит к снижению пиков окисления гуаниновых (термическая денатурация, действие сильных кислот и
и адениновых оснований при 0,86 и 1,016 В, соответст- щелочей), к изменению структуры самих оснований
венно. Предел обнаружения рифампицина, рассчитан- ДНК (окисление, метилирование, депуринизация ДНК),
ный по данному параметру, составил 10–18 М. Сам пре- а также к разрыву фосфоэфирных связей и уменьшению
парат окисляется при потенциале 0,75 В (рН = 7,4), ток средней молекулярной массы ДНК [62, 63]. Поскольку
пика линейно зависит от концентрации рифампицина в речь идет о процессах in vitro, репарация ДНК не может
интервале 20—300 нМ [58]. Соотношение пиков окис- влиять на результаты эксперимента, что облегчает трак-
ления аденина, гуанина и рифампицина, как и характер товку наблюдаемых изменений сигнала биосенсоров по
их взаимного влияния, зависят от рН и различаются для сравнению с аналогичными исследованиями с участием
нативной и денатурированной ДНК, что открывает воз- живых клеток. По той же причине малая «реальность»
можности разделения влияния сходных препаратов (что, результатов исследования модельных систем и их рас-
впрочем, еще не реализовано). пространение на живые системы требуют сопоставления
Метронидазол, антимикробный препарат, связывает- результатов измерения с принятыми тестами геноток-
ся с нативной ДНК в растворе и на поверхности стекло- сичности. В ряде случаев такая работа уже проводится,
углеродного электрода. Это приводит к уменьшению что позволяет надеяться на внедрение в будущем в
соответствующих пиков его окисления/восстановления практику анализа соответствующих ДНК-сенсоров.
в растворе и 6—8-кратному их увеличению, если ДНК Существует несколько подходов к оценке поврежде-
находится на поверхности электрода. Предполагаемый ния действия ДНК в составе электрохимических сенсо-
механизм электрохимических процессов включает по- ров. Наиболее изучен метод, по которому регистрируют
следовательное ступенчатое восстановление нитрогруп- сигналы окисления отдельных оснований в составе ДНК
пы в молекуле метронидазола. Наблюдаются также пики (гуанина, реже аденина), а также 8-оксо-гуанина (8-
окисления гуанинового остатка в ДНК. Ток пика, изме- оксо-7,8-дигидрогуанин) — индикатора окислительного
ренный в режиме дифференциальной импульсной повреждения ДНК. Исследования, проводимые с ис-
вольтамперометрии, пропорционален концентрации пользованием антрациклинов, показали, что образова-
метронидазола в интервале 0,05—60 мкМ [59]. Сходное ние 8-оксогуанина связано не только с катодным гене-
поведение обнаруживают и другие нитроароматические рированием анион-радикала кислорода, но и с согласо-
соединения [60, 61]. ванными взаимодействиями в аддукте ДНК-
Следует отметить, что практически во всех упомяну- антрациклин [24]. Изменение сигнала нуклеиновых
тых публикациях исследовали модельные растворы оснований, как отмечалось выше, не обязательно связа-
фармацевтических препаратов, а основное внимание но с повышением их доступности для электрохимиче-
уделялось не выбору условий их анализа, а количест- ского превращения при денатурации ДНК. Могут про-
венным и качественным оценкам их взаимодействия с исходить взаимодействия с образованием комплексов,
ДНК, включая электронный перенос и влияние ком- меняющие реакционную способность оснований без
плексообразования на редокс-потенциалы деполяриза- нарушения комплементарного связывания. Кроме того,
торов. Вероятно, вряд ли можно ожидать высокой се- интеркалирование в спираль ДНК увеличивает ее внут-
лективности определения, поскольку многие препараты ренний объем, что также вызывает изменение электро-
окисляются в близких областях потенциалов, а сопутст- химической активности отдельных нуклеиновых осно-
вующее изменение электрохимических характеристик ваний. Все это приводит к тому, что сигнал ДНК-
ДНК воспроизводится хуже и зачастую допускает лишь сенсора меняется разнонаправленно в зависимости от
качественное описание. Тем не менее известны приме- природы токсиканта, его активности, времени воздейст-
ры успешного применения методик измерения с помо- вия, способа включения ДНК в состав биосенсора.
щью ДНК-сенсоров для контроля лекарственных форм Например, при изучении токсического действия
препаратов [58]. отдельных соединений в концентрациях 0,05—50 мг/л
(заведомо превышающих ПДК) наблюдали изменение
Определение ДНК-повреждающих факторов
пика окисления гуанина одно- и двунитевой ДНК, элек-
и антиоксидантов
тростатически сорбированной на печатном графитовом
Данные группы соединений, несмотря на противопо- электроде [64, 65]. Наибольшее снижение сигнала за-
ложный характер их действия, целесообразно рассмот- фиксировано при действии таких эффективных интер-
реть совместно, поскольку определение антиоксидантов каляторов, как 1,2-диаминоантрахинон, 2-нафтиламин,
основано на их способности препятствовать разруше- акридиновый оранжевый, 2-аминоантрацен. Несколько
нию ДНК в присутствии сильных окислителей. При неожиданным оказалось значительное понижение сиг-
электрохимическом анализе в этих условиях наблюдает- нала гуанина в присутствии карбарила и хлорфенола,
ся уменьшение сигналов, провляющихся в присутствии токсическое действие которых с ДНК не связано. Дау-
ДНК-повреждающих факторов. номицин, цисплатин, PCB 105 (2,3,3′,4,4′-пентахлор-
74Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2008, т. LII, № 2
дифенил) в цитируемых работах вызывали увеличение Вторым по распространенности подходом к оценке
сигнала гуанина на 30—40%, что частично противоре- повреждения ДНК является электрохимический кон-
чит другим данным, полученным при изучении действия троль генерирования активных реагентов, расходую-
этих веществ в значительно более низких концентраци- щихся в реакции с ДНК. Классическим примером явля-
ях. Многие токсиканты, такие как афлатоксин, бисфенол ется реакция Фентона, в которой под действием перок-
А, нонилфенол и гидразин, на сигнал ДНК-сенсора сида водорода и ионов Fe2+ образуются гидроксильные
влияют незначительно. Переход от двунитевой к одно- и супероксидные радикалы. Поскольку реакция проте-
нитевой ДНК снижает влияние токсиканта, высота пика кает в щелочной среде, ионы металла (железа) включа-
гуанина уменьшается в 2—3 раза. ют в комплекс с ЭДТА для повышения их гидролитиче-
Сопоставление результатов тестирования модельных ской устойчивости, а для регенерации Fe2+ используют
и реальных объектов (природные и сточные воды) с либо катодную реакцию [68], либо химические восста-
помощью ДНК-сенсора и тестов генотоксичности пока- новители, например, аскорбиновую кислоту [69—71]:
зали наличие корреляции с тестами, представляющими
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH• + OH–
собой вариации теста Эймса с ревертантными штамма-
ми бактерий, содержащих ген lux люфицеразы OH• + H2O2 → HO2• + H2O
(ToxAlert™ и др.). Эти бактерии способны к биолюми-
Аскорбиновая
несценции в случае обратных мутаций, активирующих
синтез необходимого фермента. Генотоксичные вещест-
Fe3+ ⎯кислота
⎯ ⎯ ⎯⎯→ Fe2+
ва увеличивают частоту обратных мутаций, а следова-
Аналогично можно генерировать активные формы
тельно, и интенсивность свечения культуры клеток. В
кислорода с участием ряда комплексов ионов переход-
варианте этого теста используются штаммы бактерий, в
ных металлов, обладающих интеркалирующей способ-
которых ген lux закрыт белком-супрессором, освобож-
ностью. Например, в присутствии бисфенантролинового
дающим соответствующий участок ДНК при воздейст-
комплекса меди(II) происходит электроокислительное
вии токсиканта (тест umu) [66]. Сопоставление данных
расщепление ДНК, протекающее при –0,5 В с участием
тестирования образцов сточных вод из промышленных
растворенного кислорода [72]:
регионов Италии и Испании с помощью ToxAlert и
ДНК-сенсора на основе печатного графитового элек- Cu(phen)22+ + e– → Cu(phen)2+
трода и нативной ДНК показало, что сигнал бактери-
2Cu(phen)2+ + 2H+ + O2 → 2Cu(phen)22+ + H2O2
ального теста в целом в 1,5—2 раза выше, чем ДНК-
сенсора, и снижается при обработке сточных вод (их H2O2 + Cu(phen)2+ → OH– + OH• + Cu(phen)22+
очистке). Сигнал ДНК-сенсора при тестировании сточ-
ных вод, прошедших очистные сооружения, меняется Описано выделение продуктов расщепления ДНК мето-
менее регулярно, чем в случае неочищенных, грязных дом жидкостной хроматографии [73].
стоков. Сделан важный вывод о возможности использо- Генерирование гидроксильных радикалов и других
вания ДНК-сенсора для контроля качества сточных вод активных форм кислорода может быть осуществлено с
в ходе их очистки («чище—грязнее»), поскольку отно- помощью других комплексов меди(II) — бипиридиль-
сительные изменения показателей биотестов и ДНК- ного комплекса [74], с тетраазамакроциклическим ли-
сенсора коррелируют [77]. гандом [75], а также с помощью соединений марган-
Сходный подход был использован при тестировании ца(II) [76], бипиридильных комплексов рутения(II)
с помощью электрохимических ДНК-сенсоров органи- [77—80], фенантролиновых комплексов кобальта(III)
ческих загрязнителей почв [67]. Модельными токсикан- [79, 81].
тами служили аминопроизводные антрацена, нафталина, Интенсивность генерирования реакционноспособ-
хлорированные анилины и ряд ароматических сульфо- ных форм кислорода контролируют по сигналам ком-
кислот. При их действии наблюдалось линейное умень- плексов переходных металлов. Так, в случае комплексов
шение тока пика окисления гуанина нативной ДНК, меди(II) с фенантролиновыми и бипиридильными ли-
иммобилизованной путем электростатической адсорб- гандами обычно наблюдается снижение регистрируе-
ции на печатном графитовом электроде. По результатам мых токов, что связано с интеркалированием лигандов в
эксперимента рассчитывали значение параметра ЕС50, спираль ДНК и влиянием этого процесса на доступность
отвечающее концентрации токсиканта, при которой катиона металла для окисления на электроде. Напротив,
сигнал составляет 50% от его максимального значения. в случае комплексов рутения(II) и кобальта(III) проис-
Для большинства проанализированных соединений ходит закономерный рост сигнала окисления восстанов-
величина ЕС50 находится в микро- и субмикромолярном ленной формы комплекса, поскольку соответствующие
интервале концентраций. Полученные значения соот- катионы сохраняют электрохимическую активность и в
ветствуют в целом классу опасности токсиканта. Кроме интеркалированной форме. Такое поведение, несомнен-
того, исследования экстрактов почв и модельных систем но, более благоприятно для измерения сигнала, связан-
выявили соответствие между показателями ДНК- ного с повреждением ДНК, и для его интерпретации.
сенсора и результатами флуоресцентного метода опре- В рамках изучения биохимических процессов в ор-
деления 2-антрамина [67]. ганизме человека разработаны различные схемы гене-
75Г. А. Евтюгин, Г. К. Будников, А. В. Порфирьева
рации активных форм кислорода, направленные на дос- вольтамперометрические эксперименты проводятся в
тижение большего подобия модельных процессов ре- бескислородной среде, нарушения ДНК не проявляются.
альным реакциям, протекающим в живой клетке. Так, Помимо активных форм кислорода окислительное
предлагается сочетать действие кислородных окислите- повреждение ДНК вызывают и другие промежуточные
лей с различными схемами активации генотоксического продукты электрохимических реакций, например, нит-
компонента подобно тому, как это происходит в орга- розосоединения, гидроксиламины и продукты их азосо-
низме человека. С использованием цитохрома Р 450 или четания, образующиеся при частичном восстановлении
миоглобина моделируют реакции окислительной акти- нитроимидазолов [90, 91] и нитрофенолов [61]. Тиофен-
вации онкогенов, протекающие в печени и мышечной S-оксид при катодном восстановлении в присутствии
ткани. Например, при изучении метаболизма стирола нативной ДНК в растворе образует аддукт, в котором
установлено, что такая активация приводит к образова- сохраняет электрохимическую активность и в то же
нию более токсичного эпоксидного производного [79, время провоцирует разрывы нитей ДНК [92].
82]. Систему Fe(II)—H2O2 и Cu(II)—H2O2 использовали Электрохимические сенсоры использовали для опре-
для инициирования процессов повреждения ДНК в при- деления ряда других соединений, способных повреж-
сутствии органических производных мышьяковых ки- дать ДНК по другим механизмам (помимо окислитель-
слот [83]. Малотоксичные или нетоксичные в обычных ного). Так, 4,4′-дигидроксихалкон, алкилирующий реа-
условиях эти производные промотировали разрушение гент, при контакте с нативной ДНК вызывает значи-
ДНК гидроксильными радикалами, образование и рас- тельное снижение пиков окисления гуанина и аденина.
ходование которых контролировали с помощью элек- Напротив, в реакции с денатурированной ДНК в при-
трохимически активных маркеров — фенантролиновых сутствии микромолярных количеств дигидроксихалкона
комплексов кобальта(III) и рутения(II). пики окисления этих оснований увеличиваются [93].
Несмотря на то, что реакции образования значитель- Для определения процессов дезаминирования ДНК
ных количеств окислителей, способных повреждать предложено использовать сочетание метиленового си-
ДНК, в природе могут протекать только в условиях него и ферроцианид-иона. Последний выступает медиа-
экстремального загрязнения окружающей среды, их тором электронного переноса между интеркалирован-
нельзя сбрасывать со счетов, поскольку в живых орга- ным в ДНК метиленовым синим и электродом. Ток
низмах эндогенный пероксид водорода является обыч- восстановления регистрируют методом дифференци-
ным компонентом, образующимся во многих метаболи- альной импульсной вольтамперометрии. Если нуклео-
ческих процессах окисления органического вещества тидная последовательность содержит вместо цитозина
под действием оксидоредуктаз. Кроме того, с меньшей продукт его дезаминирования — урацил, электроката-
интенсивностью процессы генерирования радикальных литический отклик снижается [94].
частиц идут и с участием молекулярного кислорода. Электрохимические ДНК-сенсоры позволяют также
Важным представляется то, что повреждения ДНК регистрировать повреждения ДНК, обусловленные фи-
могут происходить в восстановительной среде — при зическими факторами. Так, термическая денатурация
катодном восстановлении молекулярного кислорода, в ДНК под действием электрического тока меняет эффек-
присутствии аскорбиновой кислоты и других восстано- тивность окислителей, генерируемых в системе Cu(II)—
вителей. Это относится и к некоторым антиоксидантам, аскорбиновая кислота—растворенный кислород. В ка-
которые поначалу рассматривались исключительно как честве маркера может служить фенантролиновый ком-
противораковые профилактические средства [84]. Позд- плекс меди(II), сигнал которого закономерно возрастает
нее участие производных галловой кислоты и кверцети- по мере увеличения продолжительности термического
на, обладающих антиоксидантным действием, в мутаге- воздействия на электрод [95].
незе получило экспериментальное подтверждение [72, Сигнал повреждения ДНК достаточно показателен
73, 85, 86]. Взаимодействие кверцетина и ДНК изучали для того, чтобы определять также вещества, снижающие
также электрохимическим методом по пикам окисления действие токсикантов. К таким веществам относятся
на стеклоуглеродном электроде компонентов, находя- прежде всего антиоксиданты — флавоноиды, полифе-
щихся в растворе. Показано, что медленное взаимодей- нолы, некоторые витамины, которые эффективно по-
ствие ДНК и кверцетина резко ускоряется в присутствии давляют действие пероксида водорода, супероксидного
комплексов меди(II). По-видимому, происходит интер- и гидроксильного радикалов, переводя их в малоактив-
калирование комплекса в спираль ДНК с последующим ные и неопасные формы — воду или молекулярный
окислительным расщеплением биополимера на фраг- кислород. Как правило, количественное определение
менты [87—89]. С помощью спектроэлектрохимических антиоксидантов протекает в две стадии — это генериро-
исследований было показано, что в ходе реакции обра- вание активных форм кислорода и оценка защитного
зуется супероксидный анион, разрушающий спираль действия определяемого соединения по относительному
ДНК. Это приводит к большей доступности для окисле- изменению тока маркера или нуклеиновых оснований.
ния остатков гуанина и аденина в ДНК, пики которых на Так, реактив Фентона использовали для оценки ан-
вольтамперограммах возрастают во времени. Также тиоксидантной активности растительных экстрактов из
происходит образование 8-оксогуанина, индикатора Peumus boldus, Baccharis genstelloides, Cymbopogom
окислительного стресса, и рост пика гуанина. Если citrates, Foeniculum vulgare, Mentha piperita и Camellia
76Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2008, т. LII, № 2
sinensis с помощью печатного графитового электрода с ДНК-сенсора является электрод ITO (оксиды индия и
нативной ДНК, электростатически адсорбированной на олова, обладающие проводимостью в тонком слое; при-
поверхности. Сигналом служит пик окисления гуанина, меняются для изготовления оптически прозрачных тон-
регистрируемый методом квадратноволновой вольтам- кослойных электродов на стеклянной подложке, предна-
перометрии [96]. В этих исследованиях использовался значенных для спектроэлектрохимических исследова-
также стандартный метод, основанный на измерении ний), покрытый фотосенсибилизирующим слоем оксида
скорости захвата стабильного радикала 1,1-дифенил-2- титана, который при УФ-облучении инициирует фото-
пикрилгидразила, измеряемой фотометрически. Реактив химические реакции образования пероксидных радика-
Фентона вызывает снижение пика окисления гуанидина, лов из воды и растворенного кислорода, и нативной
присутствие которого в растворе экстракта частично ДНК. Метиленовый синий в составе поверхностного
нивелирует действие окислителя. По результатам тести- слоя проявляет низкую электрохимическую активность
рования с помощью ДНК-сенсора антиоксидантное в силу интеркалирования в спираль ДНК, но его сигнал
действие экстрактов снижается в ряду: Baccharis увеличивался после УФ-облучения сенсора, причем ток
genstelloides > Peumus boldus > Foeniculum vulgare > восстановления маркера зависит от продолжительности
Cymbopogom citratus > Camellia sinensis > Mentha облучения. Экспериментальное значение константы
piperita. По данным стандартного метода эти антиокси- скорости зависит от концентрации антиоксиданта в
данты составляют ряд: Peumus boldus > Baccharis растворе и продолжительности облучения. При фикси-
genstelloides > Camellia sinensis > Mentha piperita > рованной продолжительности облучения концентрацию
Foeniculum vulgare > Cymbopogom citratus. антиоксиданта можно рассчитать по следующему кине-
Аналогичный электрод с фенантролиновым ком- тическому уравнению:
плексом кобальта(III) в качестве маркера использовали
1 1
для оценки антиоксидантной активности полисахаридов ( – ) –1 = a + b[AO]
дрожжей. Окислителем служила смесь фенантролиново- I 30 I 0
го комплекса меди(II) или комплекса ЭДТА-Fe(II), ас-
где I30 и I0 — токи восстановления метиленового синего
корбиновой кислоты и молекулярного кислорода. Окис-
для продолжительности облучения 30 и 0 мин, соответ-
ление ДНК приводит к снижению сигнала маркера,
ственно; a и b — эмпирические коэффициенты; [AO] —
присутствие антиоксидантов уменьшает наклон зависи-
концентрация антиоксиданта.
мости относительного изменения тока маркера от кон-
Метод позволяет определять миллимолярные кон-
центрации переходного металла в окислительной смеси
центрации антиоксидантов. Показано, что эффектив-
[97]. Метод позволяет количественно определять инди-
ность защитного действия галловой кислоты оказалась в
видуальные полисахариды в интервале 0,5—4,0 мг/мл
16 раз выше, чем глутатиона.
при концентрации маркера 0,5 мкМ и продолжительно-
В качестве маркера ДНК-сенсора при определении
сти инкубирования 10 мин.
антиоксидантов могут применяться также гетерогенные
Природные флавоноиды определяли по их влиянию
медиаторы электронного переноса, например, ферро-
на расщепление термически денатурированной ДНК
цен, ковалентно связанный с терминальным концом
активными формами кислорода, генерированными в
ДНК-зонда [101]. Повреждение олигонуклеотида, ком-
системе Cu(II)—H2O2—аскорбиновая кислота [98, 99].
плементарного зонду, активными формами кислорода,
Сигналом сенсора служит ток маркера — фенантроли-
генерированными с помощью реактива Фентона, приво-
нового комплекса меди(II), закономерно снижающийся
дит к нарушениям комплементарного связывания и как
в присутствии антиоксидантов по мере увеличения про-
следствие к снижению сигнала ферроцена, регистри-
должительности контакта с ними. В соответствии с
руемого с помощью дифференциальной импульсной
характером влияния антиоксидантная активность препа-
вольтамперометрии. Повреждение ДНК снижают тио-
ратов снижается в ряду: рутин > кверцетин > эпигалока-
мочевина, изопропанол и бензоат, правда, в достаточно
техин галлат >> катехин. Прооксидантное действие
больших количествах (10 мМ).
изученных препаратов, т.е. их участие в генерировании
активных форм кислорода, о котором говорилось выше Перспективы развития ДНК-сенсоров
[87—89], в условиях эксперимента не наблюдалось.
Выбор термически денатурированной ДНК связан с тем, Одна из основных проблем дальнейшего развития
что эта форма ДНК более чувствительна, чем нативная, ДНК-сенсоров состоит в повышении информативности
к действию окислителей [95]. сигнала и его биохимической достоверности. Эта про-
Для оценки антиоксидантного действия помимо блема может быть решена путем сочетания ДНК с дру-
переходных металлов могут использоваться электрохи- гими биохимическими компонентами, участвующими в
мически активные интеркаляторы, эффективность свя- метаболических превращениях органических соедине-
зывания которых с ДНК меняется при действии актив- ний. Речь идет о ферментах, способных в значительной
ных форм кислорода. Примером реализации такого степени влиять на сродство определяемых соединений к
подхода может служить определение глутатиона и гал- ДНК, на их ДНК-повреждающее действие, а также на
ловой кислоты по току восстановления маркера — ме- устойчивость и фармакокинетику противораковых пре-
тиленового синего [100]. Чувствительным элементом паратов. Учитывая, что до 60% онкогенов претерпевают
77Вы также можете почитать
