МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
←
→
Транскрипция содержимого страницы
Если ваш браузер не отображает страницу правильно, пожалуйста, читайте содержимое страницы ниже
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
по применению набора реагентов
для выявления мутаций в гене pncA, вызывающих
устойчивость микобактерий туберкулеза (Mycobacterium
tuberculosis complex) к пиразинамиду в клиническом
материале и культурах микроорганизмов методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим
секвенированием ДНК
«АмплиСенс® MTC-PZA-Seq»
АмплиСенс
Федеральное бюджетное учреждение науки
«Центральный научно-исследовательский
институт эпидемиологии»,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом 3аОГЛАВЛЕНИЕ
НАЗНАЧЕНИЕ .................................................................................................................... 3
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ....................................................................................... 3
ПОДГОТОВКА И ПРОВЕДЕНИЕ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ
СЕКВЕНАТОРОВ ФИРМЫ APPLIED BIOSYSTEMS, США .............................................. 4
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ДНК .......................................................................... 4
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ .................................................................................... 5
ОЧИСТКА ПРОДУКТОВ СИКВЕНСОВОЙ РЕАКЦИИ ОТ НЕВКЛЮЧИВШИХСЯ
ТЕРМИНАТОРОВ С ПОМОЩЬЮ 75% ИЗОПРОПАНОЛА .............................................. 7
АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ............................................................... 7
Форма1: REF B57-3-50F; Форма 2: REF B57-4-50F / VER 02.10.11 / стр. 2 из 11НАЗНАЧЕНИЕ
Методические рекомендации описывают порядок действий при использовании
набора реагентов для выявления мутаций в гене pncA, вызывающих устойчивость
микобактерий туберкулеза – Mycobacterium tuberculosis complex – к
противотуберкулезному препарату пиразинамиду в клиническом материале и
культурах микроорганизмов методом полимеразной цепной реакции, с последующим
секвенированием продуктов амплификации «АмплиСенс® MTC-PZA-Seq»
совместно с секвенаторами фирмы Applied Biosystems, США:
- ABI Prism 310 Genetic Analyzer,
- Applied Biosystems 3130 и 3130xl Genetic Analyzers.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
ВНИМАНИЕ! В соответствии с директивой Европейского Союза 67/548/EEC
следующие реагенты подлежат маркировке, как содержащие опасные вещества, а
также требуют указания факторов риска (R) и мер предосторожности (S):
Наименование Наименование Наименование Код опасности, по ГН 2.2.5.1313-031
реагента комплекта, в опасного (в перечень факторов
за содержанием вещества
автоматический контроль
который входит соответствии с риска (R) и мер
в воздухе рабочей зоны
разовая/среднесменная
реагент директивой предосторожности
основная опасность
67/548/EEC) (S) в соответствии с
класс опасности
вещества директивой
67/548/EEC ПДКмакс
Harmful2
Лизирующий Гуанидин
«Ампли-сорб» R:22-36/38 Нет данных
раствор хлорид
S:22
Раствор для
Не требуется
«Ампли-сорб»
опасности 4
отмывки 2 Highly Flammable2
2000/1000
Этанол R:11
Класс
Пары
Раствор для S:7-16
«Ампли-сорб»
отмывки 3
Трис-боратный
Harmful2
буфер (ТБЕ)
R: 22-26-36/37/38, 68;
концентрирован- «ЭФ» Бромид этидия Нет данных
S: 26, 28, 36/37/39,
ный с бромидом
45
этидия
Расшифровка обозначений факторов риска (R) и мер предосторожности (S).
1
Данные ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе
рабочей зоны». Класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76. ССБТ. «Вредные вещества. Классификация.
Общие требования безопасности».
2
Использованы данные о коде опасности, факторах риска (R) и мерах предосторожности (S) фирмы
Sigma-Aldrich (harmful - вредный для здоровья, highly flammable – легковоспламеняющийся).
Форма1: REF B57-3-50F; Форма 2: REF B57-4-50F / VER 02.10.11 / стр. 3 из 11R11: легко воспламеняется.
R22: опасен при проглатывании.
R26: очень опасен при вдыхании.
R36/37/38: оказывает раздражающее действие на глаза, кожу и дыхательную
систему.
R36/38: оказывает раздражающее действие при попадании глаза и кожу.
R68: возможны риски необратимых последствий.
S7: держать емкость плотно закрытой.
S16: держать вдали от источников огня, не курить.
S22: не вдыхать порошок.
S26: в случае попадания в глаза, немедленно промыть большим количеством воды и
обратиться за медицинской помощью.
S28: в случае попадания на кожу, немедленно промыть большим количеством воды.
S36/37/39: используйте специализированную защитную одежду, перчатки и средства
защиты для глаз.
S45: При неудовлетворительном самочувствии и несчастном случае немедленно
обратитесь за медицинской помощью.
ВНИМАНИЕ! При работе с легковоспламеняющимися веществами соблюдать
правила пожарной безопасности для учреждений здравоохранения ППБО 07-91 от
30.08.91.
ПОДГОТОВКА И ПРОВЕДЕНИЕ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ
СЕКВЕНАТОРОВ ФИРМЫ APPLIED BIOSYSTEMS, США
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ДНК
Рекомендуемый диапазон концентраций ДНК-матрицы, согласно протоколу
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) находится
в пределах 5-20 нг/мкл, однако мы рекомендуем использовать концентрации 15 –
25 нг/мкл. В этом случае при проведении процедуры электрофореза удобно
использовать маркеры молекулярных масс с концентрациями 15 и 50 нг/мкл, при
этом меньшая концентрация маркера совпадает с меньшей концентрацией
указанного рабочего диапазона ДНК-матрицы, в то время как бóльшая соответствует
концентрации образца, удобной для разведения.
Форма1: REF B57-3-50F; Форма 2: REF B57-4-50F / VER 02.10.11 / стр. 4 из 11После оценки концентрации ДНК в каждой пробе ПЦР-матрица разводится до
получения значений концентраций для постановки сиквенсовой реакции, согласно
нижеуказанным рекомендациям.
Если концентрация ДНК-матрицы
меньше 15 нг/мкл, тогда для проведения сиквенсовой реакции берется 2 мкл
очищенного ампликонов;
в диапазоне 15 – 25 нг/мкл, тогда берется 1 мкл;
в диапазоне 25 – 50 нг/мкл, тогда берется 0,5 мкл
больше 50 нг/мкл, тогда необходимо сделать последовательные 2-кратные
разведения исходного образца H2O стерильной для получения концентрации
ампликонов, попадающей в интервал концентраций маркеров 15-50 нг/мкл и в
реакцию взять 0,5 мкл разведенного образца.
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ
Общий объем реакционной смеси – 20 мкл, включая объем пробы ДНК-
матрицы (0,5 – 2 мкл в зависимости от концентрации матрицы).
Дополнительные реагенты, требующиеся для проведения сиквенсовой реакции:
1. набор реагентов BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems,
США), который состоит из:
• Ready Reaction Mix
• pGEM®-3Zf(+) double-stranded DNA Control Template
• –21 M13 Control Primer (forward)
• BigDye Terminator v1.1/3.1 Sequencing Buffer (5X)
2. Деионизированный формамид Hi-Di™ Formamide (для добавления в образец
перед загрузкой в секвенатор) (Applied Biosystems, США),
A. Подготовка пробирок для проведения амплификации
Для внесения реагентов и проб ДНК в пробирки используются одноразовые
наконечники с фильтрами.
ВНИМАНИЕ! До начала работы разморозить, тщательно перемешать на вортексе
все реагенты набора и осадить капли с крышек пробирок.
Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно перед
проведением анализа.
Форма1: REF B57-3-50F; Форма 2: REF B57-4-50F / VER 02.10.11 / стр. 5 из 11Для каждого анализируемого образца ДНК-матрицы секвенирование проводится в 2
пробирках, поэтому готовятся две смеси, соответственно, с прямым PZA 1 и
обратным PZA 2 праймерами.
1. Отобрать необходимое количество пробирок объемом 0,2 или 0,5 мл или 96-
луночный планшет (в зависимости от модели используемого прибора) для
амплификации исследуемых образцов.
2. В 2 пробирках объемом 1,5 мл приготовить реакционные смеси из расчета на одну
реакцию: 2 мкл Ready Reaction Mix, 4 мкл BigDye Terminator v1.1/3.1
Sequencing Buffer (5X), 3,2 мкл одного из праймеров PZA 1 или PZA 2, а также
стерильную Н2О до конечного объема 20 мкл, учитывая последующее внесение
ДНК-матрицы (0,5-2 мкл). Полученные реакционные смеси перемешать на
вортексе и осадить капли с крышки пробирки.
ВНИМАНИЕ! Контроль pGEM®-3Zf(+) double-stranded DNA Control Template с 21 M13
Control Primer (forward) используется согласно инструкции к используемому набору
реагентов для секвенирования.
3. В подготовленные пробирки для амплификации исследуемых образцов внести
соответствующий объем приготовленных реакционных смесей в зависимости от
объема добавляемой ДНК-матрицы.
4. На поверхность реакционной смеси всех пробирок добавить по капле
минерального масла (для моделей амплификаторов, не оборудованных
подогреваемой крышкой).
B. Проведение амплификации
1. В подготовленные пробирки с реакционными смесями, соответственно, с прямым
PZA 1 и обратным PZA 2 праймерами, внести 0,5-2 мкл очищенной ДНК-матрицы.
Рекомендуется осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием
на вортексе (1-3 с) перед постановкой в амплификатор.
2. Запрограммировать прибор для выполнения универсальной программы для
проведения сиквенсовой реакции (см. табл. 1).
Форма1: REF B57-3-50F; Форма 2: REF B57-4-50F / VER 02.10.11 / стр. 6 из 11Таблица 1
Температура, Продолжительность Количество
Цикл
°С этапа циклов
1 96 1 мин 1
96 10 с
2 50 5с 25
60 2 мин
3 4 хранение 1
ОЧИСТКА ПРОДУКТОВ СИКВЕНСОВОЙ РЕАКЦИИ ОТ НЕВКЛЮЧИВШИХСЯ
ТЕРМИНАТОРОВ С ПОМОЩЬЮ 75% ИЗОПРОПАНОЛА
1. В пробирки с продуктами сиквенсовой реакции добавить по 50 мкл 75%
изопропанола. Перемешать содержимое пробирок на вортексе, и оставить на
15 мин при комнатной температуре.
2. Центрифугировать пробы при 10 тыс. g/мин в течение 20 мин.
3. Удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником,
используя вакуумный отсос.
4. Добавить в пробирки по 100 мкл 75% изопропанола, мягко перемешать
переворачиванием 3 раза.
5. Центрифугировать пробы при 10 тыс. g/мин в течение 2 мин.
6. Тщательно удалить надосадочную жидкость и высушить осадок при открытых
крышках пробирок в термостате при температуре 60°С в течение 2 мин.
7. Добавить в пробирки по 10 мкл Hi-Di™ Formamide, перемешать на вортексе.
Осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием.
8. Перенести содержимое пробирок в 96-луночный планшет (например, 96-Well Plate
Base, Applied Biosystems, США) и закрыть его специальной септой и держателем
(например, 96-Well Plate Septa и 96-Well Plate Retainer, Applied Biosystems, США).
9. Денатурировать смесь в амплификаторе при 95 °С в течение 2 минут.
10. Загрузить планшет в секвенатор и задать режимы секвенирования согласно
инструкции к прибору.
АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Откройте и отредактируйте файл секвенограммы, например, с помощью
программ Деона (ООО «МАГ»), Sequence Scanner v 1.0 (Applied Biosystems),
Sequencing Analysis (Applied Biosystems), SeqMan (DNAStar), Chromas
(http://www.technelysium.com.au/chromas.html) и др.
Форма1: REF B57-3-50F; Форма 2: REF B57-4-50F / VER 02.10.11 / стр. 7 из 112. Загрузите в используемую программу (например, Деона (ООО «МАГ»), Mega 4.1
[http://www.megasoftware.net], Sequencing Analysis (Applied Biosystems), SeqMan
(DNAStar), ClustalХ [http://www.clustal.org/]) референсную последовательность из
файла PZA.fas, (см. диск, прилагаемый к набору реагентов «АмплиСенс® MTC-
PZA-Seq»). Проведите выравнивание нуклеотидной последовательности
анализируемого образца с референс-последовательностью фрагмента,
содержащего ген pncA M.tuberculosis дикого типа (GenBank accession no.
NC_000962).
3. В связи с общепринятым способом нумерация нуклеотидных
последовательностей производится с начала гена (первого нуклеотида), в то
время как при нумерации области промотора используют отрицательные
значения. Этот факт необходимо учитывать при анализе полученных данных.
Предлагаемая нами референсная последовательность начинается с области
промотора, а собственно ген pncA - с 83 позиции. Старт-кодон (ATG),
располагается, соответственно, в 83-85 позициях приложенной референсной
последовательности. В связи с этим пересчитывать нуклеотидную позицию
мутации необходимо с учетом 82 п.о. промотора.
4. Выявленный в анализируемой последовательности сайт мутации необходимо
соотнести с позицией нуклеотида в соответствующем триплете референс-
последовательности. В случае мутации, приводящей к замене аминокислоты,
можно сделать предварительный вывод о возникновении резистентности к
пиразинамиду у данного штамма микобактерий (пример интерпретации
результатов см. ниже).
Форма1: REF B57-3-50F; Форма 2: REF B57-4-50F / VER 02.10.11 / стр. 8 из 11Таблица 2
Таблица универсального генетического кода
Пример:
1. Найдено несоответствие в --11 положении анализируемой последовательности
относительно начала гена pncA: вместо буквы А (референс) находится буква G
(анализируемая последовательность). Это означает, что в промоторе гена pncA
произошла мутация, влияющая на уровень экспрессии гена.
Форма ответа - обнаружена мутация в промоторе гене pncA: —11A →G.
2. Найдено несоответствие в 35 положении анализируемой последовательности
относительно начала гена pncA: вместо буквы А (референс) находится буква С
(анализируемая последовательность). Это означает, что в 12 кодоне произошла
замена остатка аспарагиновой кислоты (Asp) на остаток аминокислоты аланин
(Ala).
Форма ответа - обнаружена мутация в гене pncA: 12 Asp (GAC)→12 Ala (GCC).
3. Найдено несоответствие в 195 положении анализируемой последовательности
относительно начала гена pncA: вместо буквы C (референс) находится буква T
Форма1: REF B57-3-50F; Форма 2: REF B57-4-50F / VER 02.10.11 / стр. 9 из 11(анализируемая последовательность). Это означает, что в 65 кодоне замены
аминокислоты не произошло.
Форма ответа - обнаружена мутация в гене pncA, не приводящая к замене
аминокислоты: 65 Ser (TCC)→ 65 Ser (TCT).
Форма1: REF B57-3-50F; Форма 2: REF B57-4-50F / VER 02.10.11 / стр. 10 из 11Лист вносимых изменений
Место внесения
Редакция Суть вносимых изменений
изменений
Титульная
13.01.11 Удалено дважды упоминаемое слово «приборами»
страница
KM
По тексту «нг» исправлено на «нг/мкл»
Исправления по шаблону
Изменено название института на ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора
По всему тексту
Добавлен раздел «Меры предосторожности» с
таблицей реагентов, подлежащих маркировке как
02.10.11 содержащие опасные вещества
LA Добавлены символ, наименование и адрес
Титульная производителя, а также символ, обозначающий
страница «изделие для in vitro диагностики»
Удалена информация из нижнего колонтитула
Нижний «Кат. №» и «дата изменения» заменены на
колонтитул соответствующие символы
Форма1: REF B57-3-50F; Форма 2: REF B57-4-50F / VER 02.10.11 / стр. 11 из 11Вы также можете почитать
