Нанотехнологии в допинговоМ контроле: перспективы приМенения Магнитной сепарации для пробоподготовки
←
→
Транскрипция содержимого страницы
Если ваш браузер не отображает страницу правильно, пожалуйста, читайте содержимое страницы ниже
методология 1/201 2(2)
Нанотехнологии
в допинговом контроле:
перспективы применения
магнитной сепарации
для пробоподготовки
И.Суханова, М.Дикунец, к.х.н., Г.Родченков, к.х.н., Т.Соболевский, к.х.н., Э.Вирюс, к.х.н.,
Федеральное государственное унитарное предприятие "Антидопинговый центр"
П
редложен новый способ экстракции допинговых препаратов из мочи чело-
века с применением нанотехнологичных ферромагнитных микрочастиц
с поверхностью, модифицированной группами С18. С применением такого
подхода степень извлечения исследуемых веществ из биожидкости человека прибли-
жается к 100%, в то время как эффект подавления ионизации соединений компонен-
тами матрицы сводится к минимуму. Время подготовки одного образца для анализа
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной
масс-спектрометрией составляет 5 минут.
Методы пробоподготовки спектрометрией (ВЭЖХ–МС/МС) [3]. Этот высо-
в допинговом контроле кочувствительный метод требует эффективной
В Запрещенный список веществ и методов Все- очистки образца, чтобы снизить эффект пода-
мирного антидопингового агентства (ВАДА) вхо- вления ионизации определяемых соединений
дят следующие классы веществ: кортикостероиды, компонентами матрицы. Традиционно для сни-
диуретики, наркотические вещества, стимуля- жения влияния эффекта матрицы на иониза-
торы центральной нервной системы, анаболи- цию соединений веществ и их концентрирова-
ческие стероиды, бета-адреноблокаторы, бета-2- ния используют жидкостно-жидкостную (ЖЖЭ)
агонисты, селективные модуляторы андрогенных или твердофазную (ТФЭ) экстракцию.
рецепторов (СМАР), агонисты дельта-рецепторов Основные достоинства ЖЖЭ – универсальность,
активации пролиферации пероксисом (δ-РАПП), простота, доступность оборудования, а также воз-
полипептидные гормоны и антиэстрогены [1]. можность селективного концентрирования. Экс-
Согласно требованиям ВАДА, предел обнаруже- трагенты, применяемые в ЖЖЭ, должны хорошо
ния запрещенных веществ или/и их метаболитов извлекать определяемые соединения или группу
должен составлять от 1 нг/мл до 500 нг/мл в зави- веществ, обладать малой растворимостью в воде,
симости от класса [2]. Для определения этих сое- иметь низкую температуру кипения. Недостат-
динений в допинговом контроле широко исполь- ками ЖЖЭ являются расход большого количества
зуется метод высокоэффективной жидкостной растворителей, плохая кинетика экстракции,
хроматографии в сочетании с тандемной масс– трудность автоматизации, а также возможное ис-
Ar 18 www.j-analytics.ru
методология 1/201 2(2)
кажение состава пробы за счет потерь летучих со-
единений при упаривании экстракта и привнесе-
ния примесей из растворителей.
Переворотом в практике пробоподготовки стал
предложенный более 30 лет назад простой и эф-
фективный метод ТФЭ, основанный на выделе-
нии компонентов сорбцией на твердом носителе.
ТФЭ основана на специфических взаимодействи-
ях компонента с сорбентом и за счет этого объеди-
нила стадии концентрирования и извлечения.
Адсорбция определяемых соединений происхо-
дит под воздействием различных нековалентных
(обычно гидрофобных) сил сорбционного взаи-
модействия. Для ТФЭ характерны более широкие
возможности варьирования природы и силы вза-
имодействия образца с сорбентом и элюентом, Рис.1. Вид ферромагнитных микрочастиц [10]
что позволяет более эффективно выделять опреде-
ляемые соединения. Однако разработка методик содержит 106 нанокристаллов маггемита (γ-Fe2O3)
с применением ТФЭ требует временных затрат диаметром около 8 нм, погруженных в поли-
для оптимизации условий ее проведения, а так- стирольную матрицу и покрытых тонким слоем
же определенного опыта и экспериментальных полимера (рис. 1) [9, 10].
навыков специалиста. Нанокристаллы оксида железа придают ми-
В допинговом контроле традиционно для из- крочастицам суперпарамагнитные свойства*,
влечения из мочи человека неконъюгированных благодаря чему микрочастицы мигрируют к маг-
веществ, таких как диуретики, стимуляторы и ниту, только когда попадают в магнитное поле.
наркотики, применяют ЖЖЭ [4]. Для извлече- После прекращения его действия они мгновенно
ния кортикостероидов, конъюгированных нар- теряют свои магнитные свойства и вновь превра-
котических веществ и анаболических стероидов щаются в суспензию [11]. Это позволяет упростить
сначала проводят ферментативный гидролиз, а и ускорить процедуру отбора экстракта после элю-
затем ТФЭ или ЖЖЭ [5, 6]. Рядом исследовате- ирования и исключить стадию упаривания. Вре-
лей [7, 8] предложены методики одновременно- мя подготовки одного образца перед анализом
го определения кортикостероидов, диуретиков, составляет всего 5 минут. На рис.2 представлена
стимуляторов, наркотиков и анаболических сте- блок-схема магнитной сепарации, на рис.3 – маг-
роидов, что позволило сократить количество про- нитный штатив для проведения сепарации.
цедур, уменьшив тем самым затраты на проведе- МС уже нашла широкое применение в био-
ние допингового контроля одной пробы. Однако химии для извлечения клеток, субклеточных
проблема больших временных затрат остается культур, белков и ДНК [12]. Магнитные микро-
актуальной, поскольку проведение ЖЖЭ и ТФЭ частицы используют для извлечения фенольных
сопряжено с длительной процедурой упаривания. соединений из водных образцов [13] и противо-
Одним из перспективных способов извлечения грибкового средства интраконазола из плазмы
полярных лекарственных препаратов и их метабо-
литов из биожидкостей человека и их концентри-
* Суперпарамагнетизм – форма магнетизма, проявляющаяся у
рования может стать магнитная сепарация (МС),
ферромагнитных и ферримагнитных частиц. Если такие частицы
имеющая ряд преимуществ перед классически- достаточно малы, то они переходят в однодоменное состояние,
ми методами экстракции. Прежде всего, она экс- то есть становятся равномерно намагниченными по всему объ-
пресснее и проще в практическом применении. ему. Магнитный момент таких частиц может случайным образом
менять направление под влиянием температуры, и при отсут-
ствии внешнего магнитного поля средняя намагниченность
Магнитная сепарация
суперпарамагнитных частиц равна нулю. Но во внешнем магнит-
Принцип МС заключается в концентрировании
ном поле такие частицы ведут себя как парамагнетики даже при
исследуемых соединений на поверхности микро- температуре ниже точки Кюри или точки Нееля. Тем не менее, маг-
частиц со средним размером 1 мкм, модифи- нитная восприимчивость суперпарамагнетиков намного больше,
цированной группами С18. Ядро микрочастиц чем парамагнетиков.
www.j-analytics.ru 19 K
методология 1/201 2(2)
Экстракция Промывка Элюирование
Рис.2. Блок-схема магнитной сепарации
крови человека [14]. Нами предложено использо- увеличению мышечной массы и силы [16]. Акти-
вать МС для извлечения лекарственных и допин- вация δ-РАПП стимулирует сжигание жировых
говых средств из такой сложной матрицы, как клеток, являющихся энергетическим депо жи-
моча человека [15]. вых организмов, что приводит к одновременно-
му увеличению выносливости и силы за счет из-
Экстракции допинговых препара- менения метаболических процессов в мышечных
тов новых классов с применением тканях [17]. СМАР и агонисты δ-РАПП, находящи-
ферромагнитных микрочастиц еся на заключительной стадии клинических ис-
При извлечении органических веществ из био- пытаний, потенциально могут использоваться
жидкости человека с применением МС эффектив- спортсменами в качестве допинга, поэтому с 2009
ность экстракции зависит от сродства определяе- года они включены в Запрещенный список ВАДА.
мых соединений к поверхности частиц. Поэтому Нами показано [15], что для экстракции из
при выборе оптимальных условий проведения мочи СМАР и агонистов δ-РАПП целесообразно
экстракции мы исследовали влияние природы, использовать 200 мкл суспензии с концентрацией
объема сорбента и элюирующих органических 1,25 мг/мл (масса сорбента 0,25 мг) магнитных ча-
растворителей. стиц с поверхностью, модифицированной груп-
В качестве объектов исследования были вы- пами C18, а в качестве растворителя (элюента) –
браны допинговые препараты новых классов – се- 150 мкл метанола.
лективные модуляторы андрогенных рецепторов В табл.1 приведены аналитические характери-
(СМАР) и агонисты дельта-рецепторов активации стики разработанного способа одновременного
пролиферации пероксисом (δ-РАПП). СМАР воз- определения δ-РАПП и СМАР с применением маг-
действуют на андрогенные рецепторы, ответ- нитной сепарации для их извлечения из мочи
ственные за рост мышечных волокон, и обладают человека и последующим анализом полученного
анаболическими свойствами, приводящими к экстракта методом ВЭЖХ–МС/МС.
Во всем диапазоне изученных концентраций
соединений (0,5–50 нг/мл) мы наблюдали селек-
тивное извлечение аналитов, причем не отме-
чали значимых изменений степени извлечения
СМАР и δ-РАПП из мочи и их степени отмывки
с микрочастиц от количества аналитов. Пре-
дел детектирования исследуемых соединений
по массе составил 0,02–0,33 нг. Было проведено
сравнение эффективности извлечения из мочи
человека допинговых препаратов методом МС
с традиционными способами экстракции, та-
кими как ЖЖЭ и ТФЭ. Показано, что в случае
МС степень извлечения аналитов была заметно
Рис.3. Магнитный штатив для проведения сепарации выше, а эффект подавления ионизации опре-
Ca 20
www.j-analytics.ruметодология 1/201 2(2) Таблица 1. Аналитические характеристики определения допинговых препаратов новых классов методом ВЭЖХ-МС/МС с применением магнитной сепарации Соединение Структурная формула Степень извлечения, % Эффект матрицы, % S-1 99 3 S-2 92 5 S-4 97 1 S-24 98 2 Q1 61 12 Q2 71 16 LGD2226 98 1 GW0742 97 2 GW501516 96 5 L-165,041 95 4 www.j-analytics.ru 21 Sc
методология 1/201 2(2)
деляемых соединений компонентами матрицы 8. Kolmonen M., Leinonen A., Kuurann T.,
ниже. Стоит подчеркнуть, что извлечение и кон- Pelander A., Ojanperä I. Generic sample
центрирование СМАР и δ-РАПП с применением preparation and dual polarity liquid
микрочастиц является более экспрессным, вре- c h rom atog r aphy-t i me - of-f l ig ht mass
мя подготовки одного образца для анализа мето- spectrometry for high-throughput screening in
дом ВЭЖХ–МС/МС составляет всего 5 минут. doping analysis. – Drug Testing and Analysis,
Предложенный метод микроэкстракции обе- 2009, v.1, p.250–266.
спечивает высокую точность, эффективность и 9. Fonnum G., Johansson C., Molteberg A.,
экспрессность всей аналитической процедуры с Morup S., Aksnes E. Characterisation of
применением масс-спектрометрии. Dynabeads by magnetization measurement
and Mössbauer spectroscopy. – Journal of
Литература magnetism and magnetic materials, 2005,
1. World Anti-Doping Agency, The 2011 v.293(1), p.41–47.
Prohibited List. International standard (2011). 10. Sinclair B. To bead or not to bead: applications of
URL: http://www.wada-ama.org/Documents/ magnetic bead technology. – The Scientist, 1998,
World_Anti-Doping_Program/WADP-Prohibited- v.12(13), p.17–20.
list/To_be_effective/WADA_Prohibited_List_ 2011_ 11. Fallesen T., Hill D.B., Steen M., Macosko J.C.,
EN. pdf Bonin K., Holzwarth G. Magnet polepiece design
2. World Anti-Doping Agency, Technical for uniform magnetic force on superparamagnetic
documents, Minimum required performance beads. – Review of scientific instruments, 2010,
levels (2011). URL: http://www.wada-ama.org/ v.81(7), p.074303-1-074303-5.
D o c u m e nt s / Wo rl d _ A nt i-D o pi n g _ P r o g r a m / 12. Hafeli U.O. Magnetically modulated therapeutic
WADP-IS-Laboratories/WADA_TD2010MRPLv1.0_ systems. - International Journal of Pharmaceutics,
M i n i mu m% 20R e qu i re d% 20P er for m a nce% 20 2004, v.277(1), p.19–24.
Levels_Sept%2001%202010_EN.pdf 13. Faraji M., Yamini Y., Rezaee M. Magnetic
3. Thevis M., Thomas A., Schänzer W. Current role nanoparticles: synthesis, stabilization,
of LC-MS(/MS) in doping control. – Anal. Bioanal. functionalization, characterization and
Chem., 2011, v.401(2), p.405-420. applications. – Journal of the Iranian Chemical
4. Deventer K., Delbeke F.T., Roels K., Van Eenoo P. Society, 2010, v.7(1), p.1–37.
Screening for 18 diuretics and probenecid in 14. Vogeser M., Geiger A., Herrmann R., Kobold U.
doping analysis by liquid chromatography- Sample preparation for liquid chromatography-
tandem mass spectrometry. – Biomedical tandem mass spectrometry using functionalized
chromatography, 2002, v.16, p.529-535. ferromagnetic micro-particles. – Clinical
5. Cho H.J., Kim J.D., Lee W.Y., Chung B.C., Biochemistry, 2008, v.41(16-17), p.1417–1419.
Choi M.H. Quantitative metabolic profiling 15. Суханова И.И., Дикунец М.А., Вирюс Э.Д.,
of 21 endogenous corticosteroids in urine by Родченков Г.М. Магнитная сепарация как
liquid chromatography-triple quadrupole-mass новый метод экстракции низкомолекуляр-
spectrometry. – Analytica Chimica Acta, 2009, ных соединений из биожидкости человека. –
v.632, p.101-108. Журнал аналитической химии, 2011, т.66(9),
6. Gonzalo-Lumbreras, Pimentel-Trapero D., с.923–930.
Izquierodo-Hornillos R. Solvent and solid- 16. Thevis M., Kamber M., Schänzer W. Screening
phase extraction of natural and synthetic for metabolically stable aryl¬propionamide-
anabolic steroids in human urine. – Journal of derived selective androgen receptor modulators
Chromatography B, 2001, v.754, p.419–425. for doping control purposes. – Rapid Commun.
7. Дикунец М.А., Апполонова С.А., Родчен- Mass Spectrom, 2006, v.20(5), p.870_876.
ков Г.М. Одновременное определение широ- 17. Narkar V.A., Downes M., Yu R.T, Embler
кого круга неконьюгированных ксенобиоти- E., Wang Y.X., Banayo E., Mihaylova M.M.,
ков методом высокоэффективной жидкостной Nelson M.C., Zou Y., Juguilon H., Kang H.,
хроматографии в сочетании с тандемной Shaw R.J., Evans R.M. AMPK and PPARβ/δ
масс-спектрометрией. – Журнал аналитиче- agonists are exercise mimetics. – Cell, 2008,
ской химии, 2009, т.64(8), с.854–864. v.134(3), p.405_415.
Ti 22 www.j-analytics.ruВы также можете почитать
