МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
←
→
Транскрипция содержимого страницы
Если ваш браузер не отображает страницу правильно, пожалуйста, читайте содержимое страницы ниже
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
по применению набора реагентов
для обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза
(Mycobacterium tuberculosis complex) методом полимеразной
цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией
«АмплиСенс® MTC-FL»
Формат FEP
АмплиСенс
Федеральное бюджетное учреждение науки
«Центральный научно-исследовательский
институт эпидемиологии»,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом 3аОГЛАВЛЕНИЕ
НАЗНАЧЕНИЕ .................................................................................................................... 3
ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ПЦР-ДЕТЕКТОРА
АLA-1/4 (SIA BioSan, Латвия) С ВЕРСИЕЙ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ 4.10 .. 4
ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ПЦР ДЕТЕКТОРА
АLА-1/4 (SIA BioSan, Латвия) С ВЕРСИЕЙ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ 5.1.0 И
ВЫШЕ ................................................................................................................................. 7
ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ПЦР-ДЕТЕКТОРА
«ДЖИН» И «ДЖИН-4» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) ) С ВЕРСИЕЙ
ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ 3.3 и ВЫШЕ (ДО ВЕРСИИ 4.4) ............................ 11
Формат FEP Форма 4: REF B57-FEP; REF Н-1074-2 / VER 25.03.21 / стр. 2 из 13НАЗНАЧЕНИЕ
Методические рекомендации описывают порядок действий при использовании
набора реагентов «АмплиСенс® МТС-FL» вариант FEP, предназначенного для
обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза (МБТ) – Mycobacterium tuberculosis
complex (MTC), в разных видах клинического материала, культурах микроорганизмов
и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией совместно с детекторами конечной
флуоресценции:
трехканальным и четырехканальным ALA-1/4 (SIA Biosan, Латвия),
двухканальным и четырехканальным детектором «Джин» (ООО «НПО ДНК-
технология», Россия).
Соответствие названий флуорофоров и каналов детекции
Название канала детекции для
Канал для флуорофора
разных моделей приборов1
канал для флуорофора FAM FAM/Специфика
канал для флуорофора JOE HEX/ВК
1
Название каналов детекции для соответствующего детектора см. в соответствующем разделе
методических рекомендаций к набору реагентов.
Формат FEP Форма 4: REF B57-FEP; REF Н-1074-2 / VER 25.03.21 / стр. 3 из 13ALA-1/4 с версией ПО 4.10
ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ПЦР-ДЕТЕКТОРА
АLA-1/4 (SIA BioSan, Латвия) С ВЕРСИЕЙ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ 4.10
Настройка теста
Для детекции и интерпретации результатов используются следующие настройки
теста:
Наименование теста - МТС.
Канал FAM - ДНК M. tuberculosis complex, канал HEX – ВКО STI-87.
Пороговые значения для канала FAM должны составлять: нижний порог
п- = 1,8, верхний порог п+ = 2,2; для канала HEX > 2,5.
Настройки теста можно просмотреть и изменить, выбрав опцию Список тестов в
главном меню Настройки. После ввода указанных значений, следует нажать кнопку
Сохранить.
Проведение детекции
1. Включить прибор и запустить на компьютере, присоединенном к прибору,
программное обеспечение ALA_1 (версия 4.1).
2. Выбрать в меню Протокол опцию Создать новый. Выбрать тип ротора
(36 х 0,5 или 48 х 0,2). Выбрать в меню тест МТС. Ввести последовательность
исследуемых и контрольных образцов, а также образцов Фон в колонке Образец
(для обозначения фоновых пробирок в графе Образец используется сочетание
клавиш Ctrl + F). Закрыть окно редактирования протокола детекции.
3. Поставить пробирки в ячейки предварительно снятого ротора прибора АLА-1/4
согласно заданной последовательности, установить ротор в модуль прибора,
закрепить его фиксатором и закрыть крышку. Запустить измерение, нажав на
значок детекции (вверху экрана) или выбрав в меню Протокол опцию
Детекция. По окончании детекции на экран будет выведена таблица
результатов. По окончании детекции сохранить полученные данные.
Примечание – Если в одном протоколе проводится детекция более 36 образцов, то
после окончания детекции партии из 36 (48) образцов необходимо извлечь ротор,
поместить в него следующую группу образцов, поставить ротор в прибор и для
продолжения детекции нажать кнопку Продолжить в окне программы.
Обработка и анализ данных
Интерпретация результатов
Полученные данные интерпретируются автоматически с помощью программного
обеспечения ПО 4.1. Результаты в таблице представляются с помощью следующих
Формат FEP Форма 4: REF B57-FEP; REF Н-1074-2 / VER 25.03.21 / стр. 4 из 13ALA-1/4 с версией ПО 4.10
обозначений:
Первый столбец (канал 1, FAM):
для образцов, в которых значение сигнала > 2,2 в графе 1 таблицы результатов
указывается МТС – обнаружено (на лиловом фоне);
для образцов, в которых значение сигнала < 2,2 в графе 1 таблицы результатов,
указывается МТС – не обнаружено (на голубом фоне);
для образцов, в которых значение сигнала > 1,8, но < 2,2 в графе 1 таблицы
результатов, указывается МТС–нд (на коричневом фоне).
Второй столбец (канал 2, HEX):
для образцов, в которых значение сигнала > 2,5 в графе 2 таблицы результатов,
указывается ВКО +;
для образцов, в которых значение сигнала < 2,5 в графе 2 таблицы результатов,
указывается ВКО –.
Интерпретация результатов
Интерпретация результатов в контрольных образцах:
Результат считается достоверным только при соответствии значений
положительного и отрицательных контролей амплификации и выделения ДНК
приведенным в табл. 1.
Таблица 1
Результаты постановки контролей различных этапов ПЦР-анализа
Контролируемый этап Результат автоматической
Контроль
ПЦР-анализа интерпретации
МТС – не обнаружено (FAM)
ОК Выделение ДНК, ПЦР
ВКО + (HEX)
МТС – обнаружено (FAM)
К+ ПЦР
ВКО + (HEX)
МТС – не обнаружено (FAM)
К- ПЦР
ВКО – (HEX)
Интерпретация результатов клинических образцов
Валидность
FAM HEX Форма выдачи ответа
результата
M.tuberculosis complex
МТС – обнаружено ВКО +/ ВКО – валидный
обнаружена
M.tuberculosis complex не
МТС – не обнаружено ВКО + валидный
обнаружена
МТС – не обнаружено /
ВКО – невалидный не валидный
МТС–нд
сомнительный,
МТС–нд ВКО – невалидный рекомендуется перезабор
материала
В случае получения:
Формат FEP Форма 4: REF B57-FEP; REF Н-1074-2 / VER 25.03.21 / стр. 5 из 13ALA-1/4 с версией ПО 4.10
значений МТС – обнаружено по каналу FAM и ВКО + или ВКО – по каналу HEX -
результат валидный - M. tuberculosis complex обнаружена.
значений МТС – не обнаружено по каналу FAM и ВКО + по каналу HEX -
результат валидный - M. tuberculosis complex не обнаружена.
результатов МТС – не обнаружено или МТС–нд по каналу FAM и ВКО – по каналу
HEX свидетельствует о невалидном результате. Требуется переамплификация
образца, в случае повторного получения аналогичного результата, необходимо
повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции ДНК. Если валидный
результат не получен, то образец обозначается как невалидный и
рекомендуется повторное взятие материала.
Результата МТС–нд по каналу FAM и ВКО + - по каналу HEX - результат
невалидный. Требуется переамплификация образца, в случае повторного
получения аналогичного результата, необходимо повторить анализ образца,
начиная с этапа выделения. Если валидный результат не получен, то образец
интерпретируется как сомнительный и рекомендуется повторное взятие
материала.
Пример полученных результатов на приборе ALA-1/4, версия ПО 4.1.
Образец №1, содержит ДНК МТС, образец №2 не содержит ДНК МТС, образец №3
требует перестановки.
Формат FEP Форма 4: REF B57-FEP; REF Н-1074-2 / VER 25.03.21 / стр. 6 из 13ALA-1/4 с версией ПО 5.1.0 и выше
ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ПЦР ДЕТЕКТОРА
АLА-1/4 (SIA BioSan, Латвия) С ВЕРСИЕЙ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ 5.1.0
И ВЫШЕ
Настройка теста
Для детекции и интерпретации результатов используются следующие настройки
теста:
Наименование теста - МТС,
Канал FAM - ДНК M. tuberculosis complex, канал HEX – ВКО STI-87.
Пороговые значения для канала FAM должны составлять: нижний порог
п- = 1,8, верхний порог п+ = 2,2; для канала HEX > 2,5.
Настройки теста можно просмотреть и изменить, выбрав опцию Список тестов в
главном меню Настройки. После ввода указанных значений, следует нажать кнопку
Сохранить.
Проведение детекции
1. Включить прибор и запустить программу ALA_1 на компьютере, присоединенном к
прибору.
2. Тест для обнаружения Mycobacterium tuberculosis complex может быть
предустановлен в программе АLА_1 если используется версия программы v.5.1.0
и выше.
3. Проверить наличие теста МТС в списке настроенных тестов программы АLА_1.
Для этого выбрать в основном меню программы Настройки → Настройка
тестов. В появившемся окне Окно настройки тестов в таблице список
тестов найти тест МТС.
4. Если тест МТС не был предустановлен в программе АLА_1, то для проведения
детекции и интерпретации результатов необходимо создать новый тест или
импортировать его через архивный файл в список тестов, используемых на
программе ALA_1.
ВНИМАНИЕ! Импорт или создание новых тестов в программе ALA_1 возможно
только для пользователей с правами администратора.
Вариант 1. Импортировать новый тест. Импорт новых тестов в программе
ALA_1 осуществляется через выбор основного меню Настройки → Импорт
тестов. Далее выбрать архивный файл в формате *.zip и импортировать его в
программу.
Вариант 2. Создать новый тест.
Формат FEP Форма 4: REF B57-FEP; REF Н-1074-2 / VER 25.03.21 / стр. 7 из 13ALA-1/4 с версией ПО 5.1.0 и выше
Выбрать в основном меню программы Настройки → Настройка тестов. В
появившемся окне Окно настройки тестов добавить название нового теста
МТС кнопкой Добавить в таблице Список тестов.
В поле Каналы для данной реакционной смеси и их обозначения задать
каналы детекции: FAM и HEX. Для этого в таблице Список каналов выбрать
канал FAM и нажать стрелку Добавить. Выбранный канал появится в
таблице Каналы и обозначения, под таблицей в поле Обозначения задать
обозначения по этому каналу МТС, в поле пороги для «+» и «-» задать «2,2» и
«1,8» соответственно. Далее для канала HEX («ВКО») установить значение
порога >2,5. Далее в поле Введите/измените тип теста выбрать тип
теста Общий.
Отметить контроли, использующиеся в этом тесте: ОК (отрицательный
контроль выделения), К+ (положительный контроль амплификации), К–
(отрицательный контроль амплификации). Выбрать алгоритмы интерпретации
для контролей по умолчанию.
В поле Таблица интерпретации результатов нажать кнопку Создать.
Программой ALA_1 будет автоматически создана таблица возможных
вариантов сочетаний результатов детекции для всех каналов и итоговый
результат для каждого из этих вариантов. Продолжением этой таблицы
являются возможные варианты сочетаний результатов контролей. Результаты
детекции клинических образцов и контролей будут выдаваться после
измерения в соответствии с этой таблицей. Сохранение теста и закрытие окна
осуществляется кнопкой ОК.
5. Создать протокол измерения.
В основном окне программы нажать кнопку Новый протокол. В
появившемся окне Окно настройки протокола выбрать тест МТС из списка
доступных тестов и нажать стрелку Добавить. Выбранный тест появится
в списке Тесты протокола.
В поле Количество образцов задать количество исследуемых образцов без
контрольных образцов и образцов Фон, нажать кнопку Добавить. В поле
Количество фоновых пробирок выбрать их необходимое количество.
В Таблице имён образцов, фоновых пробирок и контролей задать имена
образцов, добавить необходимое количество контролей. В поле Тип ротора
Формат FEP Форма 4: REF B57-FEP; REF Н-1074-2 / VER 25.03.21 / стр. 8 из 13ALA-1/4 с версией ПО 5.1.0 и выше
выбрать ротор, который будет использоваться в данном протоколе.
Сохранение протокола и закрытие окна осуществляется кнопкой ОК.
6. Поставить пробирки в ячейки модуля прибора АLА-1/4 в соответствии с заданной
последовательностью. Запустить измерение, нажав на кнопку Измерить в
панели активных кнопок (вверху экрана). Результат измерения выдаётся программой
после завершения измерения протокола в окне Окно результатов.
Обработка и анализ данных
Интерпретация результатов
Полученные данные интерпретируются программой ALA_1 с версией программного
обеспечения 5.1.0 и выше автоматически.
Интерпретация результатов
Результат считается достоверным только при соответствии значений
положительных и отрицательных контролей амплификации и выделения ДНК
приведенным в табл. 2.
Таблица 2
Результаты постановки контролей различных этапов ПЦР-исследования
Контролируемый этап Результат, отображаемый
Контроль
ПЦР-исследования прибором
ОК Выделение ДНК Не обнаружено
К+ ПЦР ОБНАРУЖЕНО (МТС)
К– ПЦР Невалидный
Интерпретация результатов клинических образцов
В случае получения:
значения ОБНАРУЖЕНО (МТС) – результат валидный – M. tuberculosis complex
обнаружена.
значения Не обнаружено – результат валидный – M. tuberculosis complex не
обнаружена.
значения Невалидный свидетельствует о невалидном результате. Требуется
переамплификация образца, в случае повторного получения аналогичного
результата, необходимо повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции
ДНК. Если валидный результат не получен, то образец обозначается как
невалидный и рекомендуется повторное взятие материала.
значения Сомнительный – результат невалидный. Требуется
переамплификация образца, в случае повторного получения аналогичного
результата, необходимо повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции
Формат FEP Форма 4: REF B57-FEP; REF Н-1074-2 / VER 25.03.21 / стр. 9 из 13ALA-1/4 с версией ПО 5.1.0 и выше
ДНК. Если валидный результат не получен, то образец интерпретируется как
сомнительный и рекомендуется повторное взятие материала.
Пример полученных результатов на приборе ALA-1/4, версия ПО 5.1.0
Образец №1, содержит ДНК МТС, образец №2 не содержит ДНК МТС, образец №3
требует перестановки.
Формат FEP Форма 4: REF B57-FEP; REF Н-1074-2 / VER 25.03.21 / стр. 10 из 13«Джин» и «Джин-4» с версией ПО 3.3 и выше (до версии 4.4)
ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ПЦР-ДЕТЕКТОРА
«ДЖИН» И «ДЖИН-4» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) ) С ВЕРСИЕЙ
ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ 3.3 и ВЫШЕ (ДО ВЕРСИИ 4.4)
Настройка теста
Для детекции и интерпретации результатов используются следующие настройки
теста:
Наименование теста - «МТС»
Канал Fam - ДНК M. tuberculosis complex, канал Hex – ВКО STI-87.
Пороговые значения для канала Fam должны составлять нижний порог «п-» = 1,9,
верхний порог «п+» = 2,1, для канала Hex > 2,5.
Настройки теста можно просмотреть, выбрав в меню «Настройки» опцию «Список
тестов». Если значения изменены, требуется восстановить начальные значения,
указанные выше, и сохранить изменения при выходе из программы.
Проведение детекции
1. Включить прибор и запустить программное обеспечение.
2. Задать протокол измерения. Ввести количество измеряемых образцов (включая
образцы «Фон»), выбрать тест МТС в списке опции Тест, нажать OK, и ввести
названия детектируемых образцов (в колонке Образец).
3. Для контрольных образцов «Фон» использовать обозначение ФОН.
4. Поставить пробирки в ячейки модуля прибора «Джин» или «Джин-4» согласно
заданной последовательности (по 12 образцов на каждый цикл детекции),
закрыть крышку прибора. Запустить измерение, нажав на значок (вверху
экрана). По окончании измерения вынуть пробирки и нажать OK.
Обработка и анализ данных
Интерпретация результатов
Полученные данные интерпретируются автоматически с помощью программного
обеспечения прибора. Результаты в таблице представляются с помощью
следующих обозначений для программного обеспечения ПО 3.3i/ ПО 4.4i
соответственно:
для образцов, в которых значение сигнала > 2,1 в столбце Специфика/Fam и > 2,5 в
столбце ВК/Hex таблицы результатов, указывается «+» (на красном фоне);
для образцов, в которых значение сигнала < 1,9 в столбце Специфика/Fam и > 2,5 в
столбце ВК/Hex таблицы результатов, указывается «–» (на зеленом фоне);
для образцов, в которых значение сигнала < 1,9 или > 1,9, но < 2,1 в столбце
Формат FEP Форма 4: REF B57-FEP; REF Н-1074-2 / VER 25.03.21 / стр. 11 из 13«Джин» и «Джин-4» с версией ПО 3.3 и выше (до версии 4.4)
Специфика/Fam и < 2,5 в столбце ВК/Hex таблицы результатов, указывается «нд»
(на оранжевом фоне).
Интерпретация результатов
Результат считается достоверным только при соответствии значений
положительного и отрицательных контролей амплификации и выделения ДНК
приведенным в табл. 3.
Таблица 3
Результаты постановки контролей различных этапов ПЦР-исследования
Контролируемый этап ПЦР- Результат, отображаемый
Контроль
иследования прибором
ОК Выделение ДНК, ПЦР «-»
К+ ПЦР «+»
К– ПЦР «нд»
Интерпретация результатов клинических образцов
Валидность
Fam Hex Форма выдачи ответа
результата
+ +/- валидный M.tuberculosis complex обнаружена
- + валидный M.tuberculosis complex не обнаружена
-/нд - невалидный не валидный
сомнительный, рекомендуется перезабор
нд + невалидный
материала
В случае получения:
результата «+» - результат валидный - M. tuberculosis complex обнаружена.
результата «-» - результат валидный - M. tuberculosis complex не обнаружена.
результата «нд» - результат невалидный. Требуется переамплификация образца,
в случае повторного получения аналогичного результата, необходимо повторить
анализ образца, начиная с этапа экстракции ДНК. Если валидный результат не
получен, то образец обозначается как невалидный и рекомендуется повторное
взятие материала.
Формат FEP Форма 4: REF B57-FEP; REF Н-1074-2 / VER 25.03.21 / стр. 12 из 13«Джин» и «Джин-4» с версией ПО 3.3 и выше (до версии 4.4)
Пример полученных результатов на приборе «Джин-4», версия 3.3i
Пример полученных результатов на приборе «Джин-4», версия 4.4i
Образец №1, содержит ДНК МТС, образец №2 не содержит ДНК МТС, образец №3
требует перестановки.
Формат FEP Форма 4: REF B57-FEP; REF Н-1074-2 / VER 25.03.21 / стр. 13 из 13Вы также можете почитать
