Orbitrap: 20 лет спустя - Лаборатория и Производство
←
→
Транскрипция содержимого страницы
Если ваш браузер не отображает страницу правильно, пожалуйста, читайте содержимое страницы ниже
От первого лица
Orbitrap: 20 лет спустя
Рассказывает директор по глобальным исследованиям в области масс-спектрометрии для наук
о жизни компании Thermo Fisher Scientific, профессор Утрехтского университета
к.ф.-м.н. Александр Алексеевич Макаров
Июль 1999 года, ежегодное заседание Американского масс-спектрометрического общества
в Далласе. Молодой ученый Александр Макаров докладывает о базовых принципах создан-
ной им масс-спектрометрической ловушки Orbitrap. Вряд ли многие из его слушателей могли
предположить, что присутствуют на историческом событии, а технологии Orbitrap суждено
изменить облик не только масс-спектрометрии, но и связанных с ней наук – протеомики, ме-
таболомики и др.
Прошло 20 лет, и сегодня многие направления исследований невозможно представить без
масс-спектрометров с ловушкой Orbitrap. Что нового в семействе приборов Orbitrap, каково
их влияние на развитие науки? Никто не расскажет об этом лучше, чем сам создатель Orbitrap,
Александр Алексеевич Макаров.
Александр Алексеевич, 20 лет – немалый срок азотный лазер, выбивавший из подложки из нержавею-
в жизни Orbitrap. Можно подводить итоги? щей стали ионы железа, которые затем инжектировались
Действительно, 20 лет – достаточно длинный путь в анализатор. Первый масс-спектрометр (МС) в октябре
от рождения первого прототипа до многих тысяч про- 1988 года показал разрешение по массе 47 тыс. и точность
данных серийных приборов. Первый прототип Orbitrap на уровне 12 ppm – совершенно неприемлемо по сегодняш-
был создан в малой фирме HD Technologies в Манчестере. ним меркам, но тогда это выглядело весьма впечатляюще.
Я был одним из ее четырех сотрудников, мы занима- В 1999 году нам удалось повысить разрешение до 150 тыс.
лись контрактной разработкой времяпролетного масс- и массовый диапазон до 1000 Да.
спектрометра (ВПМС) для анализа пептидов. А в сво- Эти результаты я и доложил 20 лет назад на ежегодной
бодное от основной работы время создавали Orbitrap, сессии Американского масс-спектрометрического обще-
чему способствовали средства выигранного нами гранта ства (ASMS) в Далласе. Тогда сразу все пошло напереко-
(50 тыс. фунтов стерлингов) Министерства торговли сяк. Не работал микрофон, и я пытался перекричать шум
и промышленности Великобритании. По возможности кондиционеров. Мои слайды коробились от жара про-
использовали старые детали. Источником ионов служил ектора, на глазах удивленной аудитории по ним бегали
DOI: 10.32757/2619-0923.2020.1.11.24.34
24 / ЛАБОРАТОРИЯ И ПРОИЗВОДСТВО / №1/2020 (11) www.labpro-media.ru
От первого лица
волны и менялись цвета. Тем не менее прибор был заявлен
и вызвал интерес со стороны как ученых, так и производи-
телей масс-спектрометрического оборудования. Однако Внешние электроды
многие специалисты приводили убедительные и абсо- Внутренний
электрод Пакет ионов
лютно справедливые доводы, почему Orbitrap никогда не
станет реально применяться в масс-спектрометрии. Начи-
ная с того, что установка была создана для импульсного Ловушка C-trap
лазерного источника, и у нас не было решения для непре-
Изменение
рывных источников ионов, таких как ионизация элек- напряжения
на центральном
трораспылением (электроспрей, ESI) – рабочая лошадка электроде
масс-спектрометрии того времени. Точность изготовле-
Ловушка Инжекция
ния электродов лежала за пределами технологических Orbitrap
возможностей тогдашних станков. Был необходим чрез-
Удержание
вычайно глубокий вакуум. Для инжекции ионов в ловушку
в электродах требовались щели, из-за чего страдала точ-
ность определения масс и т.д. Двузначное число проблем,
каждая из которых позднее стала отдельным исследова- Дифференциальный Детектируемый
тельским проектом, порой многолетним. Например, соче- предусилитель сигнал
тание Orbitrap с непрерывным источником ионов заняло
более пяти лет. Схема работы масс-анализатора Orbitrap
Тем не менее в ноябре 1999 года нас посетила делега-
ция компании Thermo Electron. И снова все пошло не так.
Стоило мне накануне визита включить прибор, как в нем тавший линейную ионную ловушку и Orbitrap. По сути,
сломался вакуумный турбонасос. Подходящий удалось мы взяли хорошо известный масс-спектрометр LTQ FT-ICR
найти у коллег, за ночь МС был восстановлен. Однако с анализатором на основе ионного циклотронного резо-
когда я пришел рано утром, чтобы завершить приготов- нанса с фурье-преобразованием (ИЦР ФП) и заменили его
ления перед демонстрацией, выяснилось, что в аппа- ловушкой Orbitrap. Новый инструмент был с энтузиазмом
ратуре, находящейся в вакуумной камере, – короткое принят масс-спектрометрическим сообществом. Что неу-
замыкание. Делегация должна уехать в полдень, поэтому дивительно – ведь он демонстрировал высокую точность
времени остановить насосы, вскрыть прибор, устранить определения масс и разрешение при высокой чувстви-
неисправность и снова откачать систему, нет. Я начал тря- тельности и быстродействии. Не случайно в 2006 году он
сти камеру с Orbitrap, и – о чудо! – замыкание исчезло, все был удостоен Золотой награды на конференции Pittcon.
заработало. Это была удача – и далеко не единственная Мы создали ключевую технологию Orbitrap, которая
на нашем пути. Достаточно сказать, что комплект элек- сейчас является базой для всех коммерческих МС компа-
тродов для ловушки был выточен в соседней мастерской нии Thermo Fisher Scientific с этой ловушкой. Технологию,
на совершенно новом станке. Никогда после ни на этом, которая изменила правила игры в биомолекулярной масс-
ни на каком-либо другом токарном станке нам не удалось спектрометрии – сначала в области протеомики, а затем
изготовить хотя бы еще один комплект работающих элек- в антидопинговом контроле, структурном анализе малых
тродов – на отработку данной технологии ушли годы. молекул и ряде других областей.
Во время визита делегации Thermo удалось проде-
монстрировать высокое по тем меркам разрешение и точ- Напомните, каковы особенности ловушки Orbitrap?
ность измерения масс. Это было убедительно, и в январе Технология Orbitrap – это целый ансамбль технических
2000 года фирма HD Technologies была приобретена решений, и каждое из них влияет на аналитические харак-
Thermo Electron. Видимо, руководство Thermo тогда инте- теристики масс-спектрометра. Изначально ионы накапли-
ресовала даже не столько технология Orbitrap, сколько ваются в изогнутом С-образном квадруполе – линейной
наш опыт и успехи в области времяпролетной спектро- ионной ловушке (C-trap), что позволило сопрячь Orbitrap
скопии. Так начался долгий путь – сначала в Манчестере, с непрерывными источниками ионов, например, с элек-
а с 2002 года – в Бремене. Путь поиска и разочарова- троспреем (ESI). Ловушка заполнена газом, за счет соуда-
ний, неудач и находок, который завершился презентацией рений с молекулами которого ионы теряют излишнюю
в 2005 году первого коммерческого прибора с ловушкой энергию и стабилизируются – неважно, что было с ионами
Orbitrap – LTQ Orbitrap. Это был тандемный прибор, соче- до этого, были они возбуждены или нет. Кроме того, мы
www.labpro-media.ru №1/2020 (11) / ЛАБОРАТОРИЯ И ПРОИЗВОДСТВО / 25
От первого лица
даем достаточное время для десольватации, что позво-
r
ляет уменьшить число кластеров в спектре. Когда нужное
число ионов накоплено, удерживающее радиочастотное
напряжение снимается, между электродами квадруполя
z прикладывается постоянное вытягивающее напряжение.
Под его воздействием ионы перпендикулярно оси C-trap
выталкиваются в Orbitrap – аналогично ортогональному
ускорителю в ВПМС. Однако в нашем случае коэффициент
передачи ионов в анализатор более чем на порядок выше,
чем в ВПМС. Причем вероятность столкновительных дис-
φ
социаций ионов минимальна, поскольку расстояние от оси
С-trap до ее выходной щели весьма мало. В результате мы
можем вводить в Orbitrap до 50% тока ионного источника.
Квадро-логарифмическое распределение потенциала Кроме того, для всех ионов автоматически обеспечивается
электрического поля в ловушке
общая начальная фаза колебаний – что очень важно для
k
2 {
U(r, z) = ⋅ z2 − r2 / 2 + R2m⋅ ln( r / Rm )} современных методов обработки сигналов.
Rm – характериcтический радиус Сама ловушка Orbitrap состоит из веретенообразного
k – константа кривизны поля
центрального электрода и двух внешних чашеобразных
Частоты колебаний: электродов, разделенных тонким диэлектрическим коль-
ωz Rm 2 (
частота вращения ωφ = (R −1 цом. Напряжение на внешних электродах поддержива-
2
Rm 2 ( ется близким к нулю. При инжекции ионов напряжение
частота радиальных колебаний ωr = ωz (R −2
на центральном электроде увеличивается, ионы начинают
ek притягиваться к нему и не могут вернуться к точке входа.
частота аксиальных колебаний ωz =
m/q
Вводимый пакет содержит сотни тысяч ионов с разными
e – заряд электрона
m и q – масса и заряд иона
начальными скоростями, и это заставляет их распреде-
литься по угловой координате – в кольца, которые вра-
щаются вокруг центрального электрода и осциллируют
Частоты колебаний в ловушке. Только частота аксиальных вдоль него. Благодаря тому, что входное отверстие распо-
колебаний зависит исключительно от отношения массы к ложено несколько сбоку от центра, специального возбуж-
заряду иона дения радиальных колебаний не требуется – кривизна поля
выполняет эту функцию.
После инжекции напряжение на центральном электроде
фиксируется так, чтобы радиусы орбит находились примерно
а
посредине между внутренним и внешними электродами (для
стандартной ловушки – примерно 10 мм). Начинается фаза
орбитального удержания – параметры колец тоже стабили-
зируются, и теоретически они могут существовать беско-
нечно долго. Мешают только соударения с молекулами газа,
неизбежно присутствующими в объеме ловушки. В резуль-
б тате в орбитальной ловушке ионы движутся по круговым
траекториям вокруг центрального электрода, осциллируя
в радиальном и аксиальном направлениях. Причем частота
аксиальных колебаний (вдоль центрального электрода) зави-
сит только от отношения массы иона к его заряду (m/z) как
ω = ek (e – заряд электрона; k – константа кривизны поля)
m/ z
и не зависит от их начальных скоростей и координат точки
входа в ловушку. Аксиальные колебания ионов наводят токи
на пару внешних электродов. Мы их регистрируем с помо-
щью дифференциального усилителя, затем обрабатываем
Разрез ионных ловушек Orbitrap: а – стандартной; сигнал посредством преобразований Фурье. В результате
б – высокопольной получаем частотный спектр, а значит – и спектр m/z.
26 / ЛАБОРАТОРИЯ И ПРОИЗВОДСТВО / №1/2020 (11) www.labpro-media.ru
От первого лица
Поскольку ионы удерживаются на орбитах электро- масс-анализа (МСn), обеспечивает разрешение 500 тыс.,
статическим полем, приложенные к ним силы не зависят а опционально – до 1 млн (для m/z = 200). Причем
от массы. А это означает очень слабую зависимость разре- динамический диапазон орбитальной ловушки – 5000:1,
шающей способности от m/z и позволяет работать в широ- а точность определения масс при калибровке по вну-
ком диапазоне масс. Детектирование методом наведен- треннему стандарту – менее 1 ppm.
ных токов обеспечивает линейный динамический диапазон Интерфейс из атмосферы в вакуум позволяет захва-
на уровне 4–5 порядков просто за счет линейности электро- тить поток ионов из нового нагреваемого источника
ники, т.е. практически неизменную чувствительность во (HESI) и провести их по нагретому капилляру в электро-
всем диапазоне масс, от водорода до вирусов. Разрешение динамическую воронку. При этом давление меняется
ограничено только глубиной вакуума и качеством электри- от атмосферного до 3,5 мбар, а затем – до 0,25 мбар.
ческого поля – мы можем детектировать даже одиночные Далее ионы проходят через различные ионно-оптиче-
многозарядные ионы. Кроме того, если ионы разрушаются ские элементы: новый сегментированный гиперболи-
внутри ловушки из-за метастабильного распада или соу- ческий квадрупольный масс-фильтр QR5, С-образную
дарений, спектр не деградирует – мы просто не видим эти ловушку и распределительный мультиполь, который
фрагменты, поскольку они некогерентны и не дают сигнала направляет ионы в линейную ловушку или в Orbitrap.
на выходном усилителе. В линейной ловушке осуществляются ионно-ионные реак-
Как развивается семейство Orbitrap?
Сегодня семейство масс-спектрометров
Orbitrap Eclipse Mass Spectrometer
на основе Orbitrap насчитывает более десяти Модифицированная
различных приборов. Линейка LTQ Orbitrap двухкамерная линейная
ионная ловушка
в первую очередь предназначалась для иссле-
Orbitrap со
довательских задач. В 2010 году у нас появи- сверхвысоким полем
лось семейство настольных приборов Exactive, Сегментированный
ориентированных на рутинные измере- квадрупольный масс-фильтр
QR5 с гиперболическими
ния. Изначально они не были гибридными, поверхностями
Камера
однако вскоре мы представили МС с предва- Улучшенный активный низкого
рительным квадрупольным масс-фильтром ионопровод давления
Удлиненная
(линейка Q Exactive). В 2013 году, с созданием Ионный камера высокого
источник
Orbitrap Fusion, родилось семейство трибрид- EASY-IC/
давления
ных МС, в 2015 году оно пополнилось прибо- ETD/PTCR Распределительный
мультиполь
ром Orbitrap Fusion Lumos. И каждое из этих С-образная ионная ловушка
семейств развивается. В 2018-м был пред- Электродинамическая ионная воронка
ставлен Q Exactive UHMR. А в 2019 году мы Прогреваемый капилляр переноса ионов с большой
пропускной способностью
выпустили два новых МС в различных клас- Ионный источник Ion Max NG
сах – Orbitrap Eclipse и новую платформу
Orbitrap Exploris 480.
В чем особенность нового масс-
спектрометра Orbitrap Eclipse?
Анонсированный в июне 2019 года
Orbitrap Eclipse – новый шаг в эволюции
платформы трибридных МС. Как и его
предшественники, он сочетает в себе
три масс-анализатора: помимо Orbitrap,
линейную ионную ловушку и квадруполь-
ный масс-спектрометр. Причем каждый
из них – самый продвинутый по своим
характеристикам. Orbitrap Eclipse позво-
ляет снимать до 40 спектров в секунду,
проводить до 10 стадий многоступенчатого Ионно-оптическая схема масс-спектрометра Orbitrap Eclipse
www.labpro-media.ru №1/2020 (11) / ЛАБОРАТОРИЯ И ПРОИЗВОДСТВО / 27
От первого лица
ции для захвата электронов либо протонов, возможны соче- дарениями с газом. Поэтому ETD в комбинации с другими
тания самых различных методов фрагментации, включая методами фрагментации стал основой для анализа белков.
диссоциацию под воздействием УФ-лазера. Ионы-продукты Однако возникает проблема – после фрагментации
измеряются либо в линейной ловушке, либо в Orbitrap. По у ионов-продуктов достаточно близки отношения m/z, но
сути, один прибор замещает лабораторию. различны массы. Исследователям белков более ценны
тяжелые фрагменты, у них больше и изотопов, и зарядо-
Но ведь подобные возможности характерны и для вых состояний. Поэтому тяжелые фрагменты распределя-
других приборов? ются по большему числу пиков с низкой интенсивностью.
Самое важное – Eclipse в первую очередь ориенти- В результате высокоинтенсивные пики более легких фраг-
рован на анализ белков, в том числе в нативной форме. ментов просто забивают в спектре пики тяжелых.
Большинство наших МС применяется в протеомике при Для решения этой проблемы и был создан метод PTCR [1].
подходе "снизу-вверх", когда сложные белки разделяются Фактически это – способ разделения многозарядных ионов,
посредством гидролиза трипсином на отдельные пеп- еще один шаг после фрагментации. Мы модифицировали
тиды с массами не более 2000 Да. Все шире использу- ионный источник тлеющего разряда EASI-IC/ETD, чтобы
ется подход "из середины-вниз" – большие белки разбива- можно было вводить другой реагент – например, перфлю-
ются на более мелкие. А вот масс-спектрометрия белков оропергидрофенантин. Его анионы из источника достав-
в нативном (естественном) состоянии только зарождается. ляются в линейную ловушку. Там они очень эффективно
Подход "сверху-вниз" включает определение молекуляр- притягиваются к положительно заряженным фрагментам
ной массы целого белка, его последующее фрагментиро- белков, происходит захват протона, заряд фрагмента сни-
вание и установление точной структуры. Конечно, данный жается, но без фрагментации. Пики тяжелых ионов сме-
метод не нов, но он редко использовался – не было прибо- щаются, а весь спектр распределяется в более широком
ров с требуемым качеством измерений цельных белковых диапазоне m/z. В результате, если раньше пики фрагмен-
молекул и комплексов. тов с массой от 15 до 25 кДа терялись под пиками фрагмен-
Orbitrap Eclipse стал качественным скачком в точности тов с меньшей массой, теперь они оказываются в области
измерений масс, и главное – в разрешении. Он позволил более высоких отношений m/z. Там мы можем их детекти-
с высокой чувствительностью измерять крайне тяжелые ровать, даже если интенсивность пиков очень низка. А это
ионы. Теперь мы видим не размытый обобщенный сигнал, позволяет на порядки увеличить надежность детектиро-
а детальный спектр. Это открывает новый уровень знаний, вания и идентификации белков. Хотя, конечно, речь идет
что, в частности, чрезвычайно важно для фармацевтиче- по-прежнему о белках среднего размера, до 50–100 кДа.
ских компаний при разработке лекарств.
Одна из особенностей Orbitrap Eclipse – в нем реали- Как же работать с более сложными белками?
зован метод уменьшения заряда путем переноса протона Для этого в Orbitrap Eclipse мы усовершенствовали линей-
(PTCR). ную ловушку. Теперь она способна и изолировать, и фраг-
ментировать ионы в диапазоне до 8000 m/z. В частности, это
Почему метод PTCR столь важен, в чем его особен- впервые позволило напрямую анализировать белки клеточ-
ности? ных мембран. А такие белки – это порядка 80% мишеней для
Традиционно для фрагментации ионов в линейной современной фармацевтики, интерес к ним огромен.
ловушке используется метод диссоциации с переносом Мы говорим именно о прорыве, поскольку понять меха-
электронов (ETD). Для этого в передней части прибора рас- низм действия мембранных белков можно только в натив-
положен дополнительный источник ионов на базе тлею- ном состоянии, ведь они работают только как белковые
щего разряда (EASI-IC/ETD). Изначально он предназначался комплексы. Однако мембранные белки неудобно анали-
для производства внутреннего калибранта. Затем этот же зировать методами масс-спектрометрии. Они нераство-
источник стали использовать для метода ETD – он генери- римы в воде, нет прямого метода переноса нативных белков
рует отрицательные ионы (анионы флуорантена или дру- в газовую фазу. Традиционный подход "снизу-вверх" – гидро-
гих реагентов), которые затем доставляются в линейную лиз белков трипсином – тут неэффективен.
ловушку и там реагируют с многозарядными катионами Для решения данной задачи Кэрол Робинсон (Carol
белков. Захватив электрон, катион белка снижает заряд Vivien Robinson) из Оксфордского университета пред-
на единицу, возрастает его внутренняя энергия, ион стано- ложила методы ионизации мембранных протеинов без
вится менее стабильным и разделяется на фрагменты. При их разрушения [2]. Белок запечатывается в нанодиски,
этом могут сохраняться очень слабые связи, которые неиз- мицеллы либо в другие контейнеры из липидов. Эти кон-
бежно разрушаются при диссоциации, инициируемой соу- тейнеры заряжаются ионным источником, вносятся в масс-
28 / ЛАБОРАТОРИЯ И ПРОИЗВОДСТВО / №1/2020 (11) www.labpro-media.ru
От первого лица спектрометр и разрушаются за счет соударений. Конечно, и исследовать в криоэлектронном микроскопе. Это направ- энергия соударений должна контролироваться, чтобы не ление исследований развивается, в частности, в Утрехтском пострадала внутренняя структура. По сути, мицелла рас- университете, профессором которого я являюсь. крывается как орех и выпускает наружу ион комплекса, Перспективно применение масс-спектрометрии который сохраняет в себе липиды и взаимодействующие совместно с кросс-линкингом – когда белковые комплексы с ним лиганды. В орбитальной ловушке мы выделяем ионы фиксируются за счет химических связей. При анализе их раз- с одним зарядовым состоянием и далее можем анализиро- деляют на пептиды, гидролизуя трипсином. Но химически вать их методом МСn, фрагментируя и выделяя требуемый связанные пептиды так связанными и останутся. Методом лиганд – однозарядный и с очень низкой массой. Можно масс-спектрометрии за три стадии фрагментации можно шаг за шагом определять последовательность аминокис- точно определить, какие именно пептиды были связаны, лот в самом белке, выяснить, какие лиганды являются и ввести дополнительные пространственные ограничения частью комплекса. Таким образом, мы определяем липид на структуру исходных белков. внутри белкового комплекса и выясняем, что же служит Иными словами, мы можем изучать структуру белковых ключом, запускающим его в работу. комплексов без электронной микроскопии. Причем улав- Все это стало возможным только благодаря расширению ливая даже переходные формы белковых комплексов. Это массового диапазона ионной ловушки в сочетании с мно- одно из перспективных направлений, которое быстро раз- гоступенчатой масс-спектрометрией. Ранее для подоб- вивается в протеомике. И здесь мы также сотрудничаем ных исследований использовались более простые при- с Утрехтским университетом. Будем надеяться, что все эти боры. Например, выпущенный в 2018 году Q Exactive UHMR многообещающие возможности войдут в арсенал генной обладал диапазоном m/z до 80 тыс. Он позволял разбить инженерии следующего поколения. мицеллу, выделить комплекс и фрагментировать его. Но не хватало стадий фрагментации, чтобы секвенировать каж- Что нового предлагает Orbitrap Eclipse для более тра- дый из фрагментов или лигандов. Orbitrap Eclipse обеспечи- диционного подхода "снизу-вверх"? вает до 10 стадий фрагментации. Конечно, на каждой ста- Возможности, о которых мы говорили, – это наиболее дии уменьшается чувствительность, но поскольку подобные интересные особенности Orbitrap Eclipse. Однако новый исследования ведутся в режиме инфузии, просто требуется МС расширяет возможности и "стандартной" протеомики. больше времени для накопления ионов в ловушке. Безус- Основное улучшение связано с ускорением анализа пеп- ловно, такие возможности прибора откроют новые пути тидов на основе тандемных массовых меток (TMT). Это к пониманию работы мембранных протеинов. разновидность изобарных (с равной массой) химических Масс-спектрометрия позволяет увидеть детали, нераз- меток, которые связываются с пептидами и используются решимые даже на электронном микроскопе. Характер- для их количественного анализа. Orbitrap Eclipse в рам- ный пример – изучение белковых комплексов рибо- ках одного эксперимента позволяет одновременно ана- сомы. Казалось бы, хорошо проработанная тема, успехи лизировать до 11 образцов, каждый из которых помечен в этой области отмечены Нобелевской премией по химии своими TMT. Подобное стало возможным благодаря рез- 2009 года. Однако в списке рибосомных протеинов при- кому ускорению процесса анализа пептидов. Прежде всего, сутствует небольшой белок SRA, про который никто не мог уже на стадии идентификации пептида проводится поиск сказать – является он частью рибосомы или нет. Только по базе данных – нужно ли этот пептид фрагментировать. с помощью масс-спектрометрии мы увидели, что он – часть На следующую стадию фрагментации направляются только нековалентного комплекса рибосомы, но только на одном те пептиды, которые с высокой вероятностью дадут хоро- из циклов ее функционирования [3]. Все остальное время он шие результаты. Поскольку каждая стадия длится 50–100 мс, отделен от нее. Поэтому данный белок присутствует в масс- экономия времени достаточно существенна. спектре непостоянно. И не в стехиометрическом соотно- Кроме того, для измерения самих меток в Orbitrap шении, а в гораздо более низком. Разглядеть SRA в криоэ- используется вычислительный ускоритель, который вдвое лектронном микроскопе невозможно. Он не появляется ни сокращает время анализа. Это результат наших работ в обла- в каких стабильных структурах. И лишь методы нативной сти численных методов обработки сигналов [4]. Хорошо масс-спектрометрии позволили обнаружить его и секве- известно, что метод Фурье имеет фундаментальное ограни- нировать. Определив моменты появления данного белка чение – он не позволяет определять частоты точнее, чем 1/Т, в рибосомном комплексе, можно понять его значение. где Т – время накопления данных. Данное ограничение пыта- В этом примере проявляется комплементарность масс- лись преодолеть все 250 лет существования фурье-анализа. спектрометрии и электронной микроскопии – выделив Его можно обойти за счет специфичности задачи – т.е. решать определенный белок, мы можем осаждать его на подложку ее не в общем виде, а с учетом ряда граничных условий. www.labpro-media.ru №1/2020 (11) / ЛАБОРАТОРИЯ И ПРОИЗВОДСТВО / 29
От первого лица
Две особенности отличают спектры сигналов в Orbitrap: сами – совершенно новое применение масс-спектрометрии.
они достаточно разрежены, а начальная фаза всех сиг- Мы надеемся на рост интереса к данному направлению.
налов имеет очень малый разброс, поскольку ионы вво- Причем уже сейчас очевидно, что Orbitrap – наиболее точ-
дятся в ловушку практически одновременно и в одной ное средство измерения массы вируса.
точке. Учитывая эти два условия, мы разработали вычисли-
тельный алгоритм на основе метода деконволюции спек- Почему именно Orbitrap? Ведь многие масс-
тра с ограничением фазы и назвали его Phased Spectrum спектрометрические методы позволяют работать со
Deconvolution Method (ΦSDM) – метод деконволюции фази- столь сложными объектами.
рованного спектра. Конечно, этот метод требует в тысячу Это вытекает из фундаментального свойства
раз больше вычислений, чем при традиционных преобразо- Orbitrap – частота аксиальных колебаний ионов в этой
ваниях Фурье, но он позволил вдвое снизить необходимое ловушке падает обратно пропорционально квадратному
время накопления данных при той же точности. Алгоритм корню из массы (ω~(z/m)1/2). Гораздо медленнее, чем, напри-
ΦSDM реализован в Orbitrap Eclipse с дополнительным огра- мер, в ИЦР-ловушке, где частота обратно пропорциональна
ничением – заранее известно, что можно анализировать массе. Поэтому никакая другая ловушка не способны захва-
спектры лишь 11 (в будущем – 16) меток. Однако это – лишь тывать и удерживать столь большие частицы. ВПМС же не
первая ласточка. В будущем мы надеемся распространить в состоянии эффективно детектировать такие частицы – они
метод ΦSDM на весь масс-спектр и вдвое увеличить произ- разгоняются до слишком низких скоростей. Кроме того, когда
водительность приборов на основе Orbitrap без изменений тяжелая частица падает на поверхность детектора, она фраг-
в электронике или механике. ментируется, образуются вторичные ионы. Но разброс вре-
мени фиксации таких ионов составляет микросекунды, что
Насколько практически важны исследования белков существенно снижает точность определения масс. Поэтому
и других тяжелых частиц? прямое измерение частоты в Orbitrap – оптимальный способ
Сегодня анализ мембранных белков – очень горячая работы с тяжелыми структурами, в том числе – с вирусами.
область науки, поскольку она позволяет непосредственно Самое же главное – мы видим аномально длительное
изучать механизмы взаимодействия лекарств с целевыми время жизни вируса в ловушке Orbitrap, многие секунды,
белками. Теперь можно напрямую увидеть, к какой точке что обеспечивает высокое отношение сигнал/шум
подходят лекарства, как происходит их захват, как они и позволяет измерять массу вируса очень точно. Ведь ско-
влияют на деятельность белков и т.п. Аналогичные задачи рость вируса в ловушке из-за гигантской массы настолько
возникают и в вирусологии – например, как происходит мала, что, несмотря на его огромное сечение, соударения
взаимодействие вируса с клеткой. Напомню, эндоген- с остаточным газом приводят не к фрагментации, а лишь
ные вирусы весьма велики – их диаметр доходит до 25 нм, некоторому замедлению. И мы продолжаем наблюдать
а масса может превышать 1 МДа. МC Q Exactive UHMR позво- его сигнал. Маленькие протеины разлетаются при един-
лил напрямую измерять массу вирусов, причем с недости- ственном столкновении с молекулой остаточного газа,
жимой прежде точностью – до 0,1%, а в будущем, возможно, вирус может соударяться тысячи раз. Еще недавно подоб-
и до 0,01%. Такой точности и диапазона масс уже доста- ное утверждение не было очевидным, хотя мы и пред-
точно, чтобы определить, насколько полной является ДНК сказывали такие возможности. Сейчас же мы их видим
под оболочкой вируса. в реальных экспериментах.
Более того, мы научились измерять непосредственно
массу отдельного вируса, а не работать с усредненными значе- Orbitrap Exploris 480 – прибор другого класса?
ниями. Вирусы даже одного вида достаточно гетерогенны. Их Этот МС – первый представитель нового, уже четвер-
внешние оболочки несколько различаются – где-то недостает того поколения Orbitrap. Сегодня в Германии популярен
одного протеина, где-то – другого, где-то – третьего. Это меха- термин "Индустрия 4.0". Мы назвали новое семейство
низм защиты вирусов от распознавания и реакции со стороны Orbitrap 4.0, поскольку в нем заложена сходная концепция
иммунной системы. В масс-спектре такая гетерогенность про- взаимодействия интеллектуальных блоков. Она обеспе-
является как огромный холм, в котором невозможно разли- чивает дистанционную диагностику, надежность и само-
чить отдельные пики. Поэтому столь важно уметь анализиро- калибровку прибора.
вать каждый вирус индивидуально, что легко достигается при Новое семейство развивает архитектуру плат-
детектировании методом наведенного тока. формы Q Exactive – это настольный прибор с квадрупо-
Вирусы становятся одним из наиболее перспектив- лем для селекции ионов и ловушкой Orbitrap для ана-
ных средств доставки в генной инженерии, которая может лиза фрагментов в широком диапазоне масс. Однако
реально изменить будущее здравоохранения. Работа с виру- Orbitrap Exploris 480 – совершенно новый прибор. При его
30 / ЛАБОРАТОРИЯ И ПРОИЗВОДСТВО / №1/2020 (11) www.labpro-media.ruОт первого лица
Orbitrap со сверхвысоким полем
Прогреваемый капилляр Улучшенный активный
переноса ионов с большой ионопровод
пропускной способностью
Ионный Усовершен-
источник ствованный
EASY-IC для квадруполь
внутренней
калибровки
Независимый Ловушка
детектор заряда C-Trap
Ионный
источник Электродинамическая Распределительный
OptaMax NG ионная воронка мультиполь
Ионно-оптическая схема масс-спектрометра Orbitrap Exploris 480
создании мы следовали принципу "Лучше меньше, да лучше". ших советских ученых в Канаде была создана компания
В результате новый прибор по объему в 2,5 раза меньше, чем Ionalytics, в США – Sionex. В итоге первая вошла в состав
Q Exactive. Он оптимизирован для удобного обслужива- Thermo Fisher, вторая – в AB Sciex (она продвигает FAIMS
ния и обеспечивает простой доступ к различным блокам. под торговой маркой SelexION). Метод основан на том, что
В МС всего одна алюминиевая вакуумная камера. Она уста- зависимость подвижности ионов от напряженности поля
новлена над единственным турбомолекулярным насосом. перестает быть линейной в сильных полях. В спектрометре
Насос разработан специально для Orbitrap Exploris, осна- FAIMS на электроды сначала на короткое время подается
щен шестью портами и обеспечивает весь необходимый высокое напряжение, а затем на более длительное – низкое.
диапазон низких давлений – от 10–3 до 10–10–10–11 бар. Интегральное напряжение равно нулю, но для иона это воз-
Orbitrap Exploris 480 вобрал в себя лучшие реше- действие оказывается нескомпенсированным. В результате
ния от других наших масс-спектрометров. В частности, через такой фильтр удается пройти только определенным
передняя часть прибора – источник ионов и интерфейс ионам, остальные падают на электроды.
из атмосферы в вакуум, а также ионный источник для вну- Мы реализуем фильтр в виде изогнутого цилиндра,
треннего калибранта EASY-IC – такая же, как в Orbitrap с центральным и внешним электродами, между которыми
Fusion Lumos. Используется компактная ловушка прикладывается несимметричное пилообразное напряже-
Orbitrap со сверхвысоким полем. Поддерживаются ние. Такая геометрия позволяет фокусировать ионы в про-
отдельные опции Orbitrap Eclipse, в частности – ускорен- странстве, а также закрывает прямую линию от источника
ные методы работы с метками ТМТ за счет алгоритма ионов до масс-спектрометра и тем самым предотвращает
ΦSDM. Что крайне важно – реализована опция спектро- попадание в него частиц пыли, фрагментов фазы и других
метрии ионной подвижности с асимметричным полем загрязнений. В результате до масс-спектрометра доходят
(FAIMS – Field asymmetric ion mobility spectrometry), ионы только с определенной зависимостью подвижности
доступная и в Orbitrap Eclipse. от напряженности поля. Конечно, в итоге ионный ток сни-
жается, но возрастает соотношение сигнал/шум, поскольку
В чем отличие FAIMS от традиционной спектроме- фильтруется исходная матрица. Причем этот эффект виден
трии ионной подвижности? не только для малых молекул, где матрица сильно отлича-
Эта технология была разработана в 1970–80-е годы ется от аналита, но и для пептидов. Выбирая нужные зна-
в СССР научными группами в Новосибирске (Институт гео- чения напряжения, можно выделять те или иные классы
логии и геофизики СО РАН) и в Ташкенте (Институт элек- пептидов. В итоге, сокращая общее число детектируемых
троники АН РУз). В конце 1990-х – начале 2000-х ее успешно пептидов, мы видим их большее разнообразие в рамках
коммерциализировали за рубежом: при участии быв- выбранного класса и в конечном итоге детектируем больше
www.labpro-media.ru №1/2020 (11) / ЛАБОРАТОРИЯ И ПРОИЗВОДСТВО / 31От первого лица
различных белков. Поэтому возлагаем большие надежды с высоким разрешением в Orbitrap необходимо порядка
на метод FАIMS и в протеомике, и в следовом анализе, равно 128 мс, следовательно, более 99% ионов пробы не использу-
как и в самых обычных аналитических задачах. ется для масс-анализа. В результате, несмотря на большой
динамический диапазон, остается проблема регистрации
Orbitrap Exploris 480 ориентирован на научные сигналов пептидов с низкой концентрацией в образце – их
задачи или на рутинные применения? отношение сигнал/шум оказывается слишком низким.
Технические характеристики Exploris 480 находятся Авторы метода BoxCar предложили разделить весь
на уровне параметров масс-спектрометров семейства массовый диапазон на ряд узких поддиапазонов, с рав-
Q Exactive или превосходят их. Новый прибор фактически ным количеством зарядов – например, на 10 поддиапазо-
заменяет Q Exactive HF, он самый продвинутый в линейке нов с зарядом по 10 тыс. в каждом. Ионы каждого из под-
Q Exactive и, соответственно, самый дорогой. Однако это диапазонов накапливаются отдельно. Это возможно
лишь первая ласточка. В ближайшие годы семейство благодаря наличию в МС предварительного аналитиче-
Orbitrap 4.0 должно существенно расшириться вниз, ского квадруполя и детектора зарядов. Очевидно, воз-
что полностью изменит представление о возможностях растает общее время накопления в C-trap, так как более
и доступности Orbitrap для рутинных анализов. редкие частицы будут накапливаться дольше, например,
Уже много лет как был съеден торт, посвященный 10–20 мс. Но отношение сигнал/шум их пиков возрастает
выпуску 5000-го масс-спектрометра семейства при- многократно. В результате при одновременной инжек-
бора Orbitrap. И большая часть этих приборов – именно ции всех ионов в Orbitrap динамический диапазон ока-
Q Exactive. В основном они используются в протеомике, но жется в десятки раз выше, чем при стандартном запол-
стали активно внедряться в биофармацевтику. При раз- нении. Вот яркая демонстрация того, сколько резервов
работке новых антител в основном работают с Orbitrap, таит в себе Orbitrap при более тонком, умном использо-
что неудивительно – полный цикл анализа моноклональ- вании. Причем резервов, недостижимых для методов
ных иммуноглобулинов выполняется на одном приборе. "грубой силы", таких как увеличение возможностей самой
Можно провести анализ "из середины-вниз", т.е. разбить ловушки или даже числа ловушек.
иммуноглобулин на легкую и тяжелую цепи и для каж- Нам есть над чем работать. Мы добились высокой чув-
дой из них проанализировать последовательность ами- ствительности и селективности в транспортных квадру-
нокислот. А затем выполнить пептидное картирование полях, но еще толком не умеем, используя только целевые
и полностью восстановить последовательность амино- ионы, сохранять другие для будущих измерений. А ведь
кислот в антителе. И далее провести анализ гликанов, это позволит увеличить чувствительность на порядки.
вплоть до очень низкого уровня обнаружения – 0,1–0,01%. Немалый выигрыш сулят улучшения в интерфейсе для
Более того, Orbitrap позволяет измерять нековалентные ввода ионов.
комплексы лекарство–антитело, определять, сколько В целом же развитие масс-спектрометрии я вижу
лекарства прилипает к этому антителу, измерить анти- в великом слиянии разных методов, в сочетании их силь-
тело в денатурированном виде. ных сторон.
Как вы видите техническое развитие МС на основе Вы говорите об интеграции именно спектрометри-
Orbitrap? ческих методов?
В развитии самой ловушки Orbitrap мы продвинулись Не только. Одно из очень многообещающих направ-
достаточно далеко. Ее пропускание близко к теорети- лений развития – объединение масс-спектрометрии
ческому пределу – можно анализировать не менее 50% и других аналитических подходов. Например, комби-
ионов от источника. Поэтому дальнейшее совершенство- нация масс-спектрометра со спектроскопией холодных
вание я вижу в направлении более умной реализации ионов. В этой области мы сотрудничаем с научной груп-
возможностей МС в целом. пой профессора Олега Бояркина в Федеральной политех-
Характерный пример – метод BoxCar, разработанный нической школе в Лозанне. Они используют криогенное
Матиасом Манном (Matthias Mann) и Флорианом Мае- охлаждение ионов для резонансной ионизации с помо-
ром (Florian Meier) [5]. Практически всем ловушкам при- щью УФ- и ИК-лазеров. В частности, ИК-спектры позволяют
суща проблема ограничения по объемному заряду ионов. получить информацию о молекулярных связях, о тон-
В частности, в С-trap нельзя накапливать ионы с суммар- кой структуре молекулы. С помощью УФ-фрагментации
ным зарядом более 106. В современных высокопроизво- можно разделять изомеры и для каждого из них по соче-
дительных ионных источниках такое количество ионов танию спектра оптического поглощения и масс-спектра
генерируется менее чем за 1 мс. Для измерения спектра фрагментов получать уникальный "отпечаток пальцев".
32 / ЛАБОРАТОРИЯ И ПРОИЗВОДСТВО / №1/2020 (11) www.labpro-media.ruОт первого лица
Охлаждаемая
ионная ловушка
Линза
Лазерный луч
Окно Брюстера
Окно Брюстера
Транспортный Транспортные октополи
квадруполь
Orbitrap
Транспортный
гексаполь
Ионная воронка
Ионный источник ESI
С-trap Столкновительная
ячейка
Схема комбинированного масс-спектрометра со спектрометрическим анализатором холодных ионов
В подобных экспериментах масс-спектрометр слу- использовать для проведения химических реакций, не
жит для выделения и транспортировки целевых ионов. реализуемых никаким другим путем. Что немаловажно,
Они фрагментируются в криоохлаждаемой линей- для таких экспериментов масс-спектрометры Orbitrap
ной ловушке (10–15 К) посредством перестраиваемого подходят как нельзя лучше – в них ячейка соударений
УФ-лазера. Затем фрагменты направляются в Orbitrap находится в "хвосте" прибора, за ней можно размещать
для измерения их масс-спектров как функции от длины любые дополнительные модули.
волны облучения. Поскольку быстродействие Orbitrap Мы проводили работы по мягкому осаждению ионов
достигает 40 спектров в секунду, УФ-МС-спектр строится на наноэлектромеханические резонаторы. Добавление
за считаные секунды. Можно определить собственно даже одного иона на колеблющийся кантилевер субми-
спектр поглощения интересующих ионов, а затем про- кронных размеров изменяет частоту его собственных
водить целевой анализ, воздействуя УФ-излучением колебаний, что позволяет очень точно измерить массу
на определенные функциональные группы. Например, отдельной частицы.
метод позволяет определить точную структуру отдель- Несколько лет назад в состав Thermo Fisher Scientific
ных мономеров сахаров, липидов и т.п. Возможно опре- вошла компания FEI – один из мировых лидеров в области
делять присутствие до пяти изомеров в смеси с точно- электронной микроскопии. В результате для нас откры-
стью до нескольких процентов. Уже продемонстрирована лись совершенно новые возможности. Мы можем осаж-
эффективность метода при разделении эфедрина и псев- дать выбранные ионы непосредственно на подложку для
доэфедрина [6], а также пептидов с двумя изомерными микроскопа. По сути, это новый вид пробоподготовки
остатками треонина [7]. Полагаю, в сложных аналитиче- в электронной микроскопии. В этом направлении мы
ских случаях данный подход будет использоваться все сотрудничаем с группой Кэрол Робинсон в Оксфордском
активнее, он вполне пригоден для коммерциализации. университете.
Другое интересное направление – мягкая посадка Так что интересных для исследований направлений
ионов. С помощью масс-спектрометра можно отбирать много. Хотя об их серийной реализации говорить пока
нужные ионы и с низкой энергией осаждать их на опреде- рано.
ленную поверхность. Причем и в газовой фазе, и в ваку-
уме. Такой подход эффективен не только для аналитиче- Вы являетесь профессором Утрехтского универ-
ских, но и препаративных задач. В частности, профессор ситета. Как эта деятельность сочетается с работой
Университета Пердью Юлия Ласкина на основе данного в Thermo Fisher?
подхода работает над созданием двумерных материалов, В Утрехтском университете я работаю в тесной связке
различных экзотических структур [8]. Этот метод можно с профессором Альбертом Хеком. Студенты из Утрехта
www.labpro-media.ru №1/2020 (11) / ЛАБОРАТОРИЯ И ПРОИЗВОДСТВО / 33От первого лица
приезжают в Бремен и по нескольку недель проводят Возможно ли использовать Orbitrap в промышленно-
исследования на наших новейших приборах. В том числе сти, например, в лабораториях контроля качества пред-
на тех, которые еще не вышли на рынок. Публикуют статьи, приятий?
пишут диссертации. Потенциально – да. Сейчас Orbitrap относится
Зачастую работа направлена на модификации приборов к Hi-End-сегменту приборов, но технически ничто не пре-
для определенных задач. На таких инструментах специали- пятствует сделать его массово доступным, на уровне ква-
сты выполняют свои исследования, публикуют результаты. друполей. В том числе – для рутинного контроля каче-
Если интерес научной общественности к новым модифи- ства, от фармацевтики, где требования наиболее высоки,
кациям достаточно велик, можем сделать их доступными до обычных химических производств. Однако в нашей
в серийных приборах. компании масс-спектрометрия исторически входит
В целом работы с Утрехтским университетом направ- в подразделение наук о жизни. Это фактически отдель-
лены на увеличение числа объектов исследований посред- ная структура, бизнес которой последние 30 лет сосре-
ством масс-спектрометрии. Изучение рибосомных бел- доточен в наиболее доходной части рынка – в исследо-
ковых комплексов, совместное применение МС-методов вательском секторе. Да, промышленные применения
и кросс-линкинга для восстановления структуры белков, означают более рутинный, более простой анализ. Но,
о которых я рассказывал, – все эти работы проводились с другой стороны, он гораздо более требователен с точки
совместно c научной группой Утрехтского университета. зрения надежности, понятности и интегрированности.
Массовые продажи требуют иной организации всего биз-
Вы продолжаете сотрудничать с российскими науч- неса: нужны новые сети сбыта, технической поддержки
ными группами? и т.д. Главное же – необходимо изменить мышление
Конечно, сегодня в Thermo Fisher Scientific очень жестко самого бизнеса. Это долгий путь, он гораздо тяжелее, чем
отслеживаются все экспортные мероприятия, но на науч- разработать новый прибор. Технология не заставит себя
ных контактах это не отражается, меня никто не ограничи- ждать, хотя и потребуется другая культура производства,
вает. Мы по-прежнему взаимодействуем с Институтом про- иные принципы его организации.
блем химической физики РАН, Институтом общей физики Последние 15 лет развитие Orbitrap шло именно
им. А.М.Прохорова РАН, с Институтом геохимии и анали- эволюционным путем. За это время бизнес сильно
тической химии им. В.И.Вернадского РАН. В основном это изменился, он стал более широким, всеобъемлющим,
более глубокое изучение процессов ионизации, от электро- вышел на новые рынки. Но взрывообразного роста,
распыления ионов до их ввода в масс-спектрометр. Также к сожалению, не произошло из-за сложности входа
исследуем процессы лазерной ионизации с различными в новые рынки. Хотя налицо тенденции, которые вну-
матрицами. Продолжаем сотрудничать с лабораторией шают оптимизм.
А.Т.Лебедева в МГУ, занятой интересными работами в обла-
сти протеомики. В основном – анализом циклических пеп- Спасибо за интересный рассказ.
тидов, который очень трудно автоматизировать. С А.А.Макаровым беседовал И.В.Шахнович
Литература
1. Huguet R., Mullen C., Srzenti K., Greer J.B., Fellers R.T., for Fourier Transform Mass Spectrometry // Anal. Chem. 2017. V.
Zabrouskov V., Syka J.E.P., Kelleher N.L., Fornelli L. 89, N 2. P. 1202–1211.
Proton transfer charge reduction enables highthroughput 5. Meier F., Geyer P.E., Virreira Winter S., Cox J., Mann M.
top-down analysis of large proteoforms // Anal. Chem. BoxCar acquisition method enables single-shot proteomics
2019. V. 91, N 24. P. 15732–15739. at a depth of 10,000 proteins in 100 minutes // Nature
2. Robinson C.V., et al. Detergent-free mass spectrometry Methods. 2018. V. 15, N 6. P. 440–448.
of membrane protein complexes // Nature Methods. 2013 6. Kopysov V., Makarov A., Boyarkin O.V. Identification of
Dec. V. 10, N 12. P. 1206–1208. Isomeric Ephedrines by Cold Ion UV Spectroscopy: Toward
3. van de Waterbeemd M., Fort K.L., Boll D., Makarov A., Practical Implementation // Anal. Chem. 2017. V. 89. P. 544−547.
Heck A.J.R., et al. High-fidelity mass analysis unveils 7. Boyarkin O.V., et al. Method for Identification of Threonine
heterogeneity in intact ribosomal particles // Nature Isoforms in Peptides by Ultraviolet Photofragmentation of Cold
Methods. 2017. V. 14. P. 283–286. Ions // Anal. Chem. 2019. V. 91. P. 6709−6715.
4. Grinfeld D., Aizikov K., Kreutzmann A., Damoc E., 8. Ласкина Ю. Услышать разговоры клеток // Лаборато-
Makarov A. Phase-Constrained Spectrum Deconvolution рия и производство. 2018. № 2. С. 8–14.
34 / ЛАБОРАТОРИЯ И ПРОИЗВОДСТВО / №1/2020 (11) www.labpro-media.ruВы также можете почитать
