КОЛИЧЕСТВЕННАЯ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ В ДИАГНОСТИКЕ ГРИППА И КОНТРОЛЕ ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА "ТРИАЗАВИРИН"
←
→
Транскрипция содержимого страницы
Если ваш браузер не отображает страницу правильно, пожалуйста, читайте содержимое страницы ниже
ISSN 0868–5886 НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 1, c. 55–61
СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ ПРИБОРОВ
И ИЗМЕРИТЕЛЬНЫХ МЕТОДИК
УДК 543.51: 577.1: 66.096.3
А. В. Протасов, Р. А. Бубляев, О. А. Миргородская, 2020
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ
В ДИАГНОСТИКЕ ГРИППА И КОНТРОЛЕ ДЕЙСТВИЯ
ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА "ТРИАЗАВИРИН"
Для совершенствования методов диагностики и лечения заболевания гриппом в настоящей работе проведе-
ны количественные масс-спектрометрические исследования активности двух основных карбоксипептидаз —
ангиотензинпревращающего фермента и карбоксипептидазы-N. Проведены сравнения уровней активности
этих пептидаз для здоровых и инфицированных вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) мышей, а также для
мышей, пролеченных экспериментальным противогриппозным препаратом "Триазавирин".
Анализ, подобный продемонстрированному в данной работе, может быть с успехом использован при срав-
нительной оценке эффективности и других антигриппозных препаратов, а также для понимания направле-
ния их воздействия на инфицированный организм.
Кл. сл.: ангиотензин I, ангиотензинпревращающий фермент, карбоксипептидаза N, брадикинин,
количественная масс-спектрометрия
ВВЕДЕНИЕ фекта, включающего вазоконстрикцию, синтез
и секрецию альдостерона, секрецию вазопрессина,
Грипп в различных его формах в виде сезонных запуск норадренергической активности и регуля-
вспышек или пандемий остается серьезной про- цию синтеза ренина в почках. Рецепторы ангио-
блемой общественного здравоохранения. Инфек- тензина II обнаружены в сердце, кровеносных со-
ция гриппа у человека может протекать судах, почках, надпочечниках, легких и головном
по-разному: от бессимптомной инфекции до ос- мозге. Ангиотензин II образуется из ангиотензи-
ложненных форм, включая тяжелую вирусную на I в результате отщепления двух C-концевых
пневмонию и обострение имеющихся хронических аминокислот ангиотензинпревращающим фермен-
заболеваний. Сезонные эпидемии гриппа ежегодно том (АПФ).
могут поражать до 15 % населения. Это указывает Помимо ангиотензина I, АПФ гидролизует
на важность создания новых и улучшения сущест- и другие пептиды плазмы крови, а также инакти-
вующих вакцин и лекарств. вирует пептид, обладающий сосудорасширяющим
Вирус гриппа заражает в основном эпителиаль- действием, — брадикинин [1]. Брадикинин играет
ные клетки верхних дыхательных путей, распро- важную роль в регуляции кровообращения в усло-
страняясь затем и на клетки нижних дыхательных виях острых воспалительных реакций различного
путей. Значительное число пораженных клеток, патогенеза [2]. Он является одним из самых силь-
возникающее при недостаточном иммунном отве- ных сосудорасширяющих средств в организме,
те организма, собственно, и приводит к наруше- повышает проницаемость капилляров и способст-
нию функции органов и систем органов, в первую вует выходу жидкости из кровеносного сосуда
очередь нервной и сердечно-сосудистой систем. (вызывает отек). С этой точки зрения брадикинин
Эти нарушения проявляются в общих и локальных вместе с гистамином и простагландинами относят
изменениях в регуляции кровоснабжения органов к медиаторам воспаления.
и тканей. В метаболизме брадикинина, помимо АПФ,
В регуляции кровяного давления и водно-со- участвуют еще по крайней мере две протеиназы —
левого баланса принимает участие ренин-ангио- аминопептидаза P и неприлизин (карбоксипепти-
тензиновая система, которая является наиболее даза N), которые отличаются продуктами гидроли-
важной и достаточно хорошо изученной. Участни- за. АПФ расщепляет связь (7–8), а аминопептидаза
ком этой системы является ангиотензин II — ко- и карбоксипептидаза отщепляют соответственно N
нечный продукт каскада протеолитических про- и C концевые аминокислоты.
цессов. Свое влияние ангиотензин II оказывает Таким образом, активность протеиназ, участ-
через ангиотензиновые рецепторы, являющиеся вующих в метаболизме ангиотензина I и брадики-
медиаторами основного сосудосуживающего эф- нина в тканях дыхательных путей, будет отражать
5556 А. В. ПРОТАСОВ, Р. А. БУБЛЯЕВ, О. А. МИРГОРОДСКАЯ
развитие патологического процесса при гриппе, эвтаназии, забирали кровь и бронхиальный смыв
что и являлось предметом изучения в настоящей (лаваж).
работе.
Оптимальным материалом для исследования Получение стандарта из ангиотензина II
можно считать бронхиальный смыв — лаваж. и брадикинина
Традиционно активность пептидаз измеряют с ис- Стандарты подготавливались из ангиотен-
пользованием хромогенных или флюорогенных зина II и брадикинина ("Sigma-Aldrich"). Навеску
субстратов, а также в условиях сложных смесей 2.1 мг пептида растворяли в 20 мкл 10 % трифтор-
в присутствии ингибиторов. Однако выбор и син- уксусной кислоты (ТФУ, "Sigma-Aldrich") в H218O
тез специальных субстратов и ингибиторов сам по (97 % 18O, "Cambridge Isotope Laboratories
себе является сложной задачей [3]. Кроме того, Andover", MA, USA) и инкубировали в твердо-
упомянутые протеиназы относятся к металлопро- тельном термостате при 70 °С в течение 90 мин
теиназам, что указывает на то, что можно ожидать для протекания изотопного обмена, после чего
перекрестного действия ингибиторов. Поэтому высушивали в вакуумном испарителе SpeedVac
в данной работе использовались нативные суб- ("Eppendorf"). Содержимое пробирки растворяли
страты, активность во времени которых измеря- в воде и использовали в качестве стандарта для
лась методом количественной масс-спектро- определения концентрации пептидов.
метрии, ранее разработанным и опробованным MALDI-TOF масс-спектрометрия
авторами [4, 5]. Исследуемые образцы смешивали с матрицей
HCCA ("Bruker", Германия), наносили на ми-
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ шень GroundSteel ("Bruker", Германия) и анализи-
ровали на масс-спектрометре MALDI-TOF / TOF
Тестируемые препараты ultrafleXtreme ("Bruker", Германия) в режиме об-
Исследуемый препарат "Триазавирин", предос- наружения положительных ионов. Для каждого
тавлен ООО "Завод Медсинтез". спектра было суммировано 5000 лазерных им-
пульсов. Идентификация белков проводилась
Экспериментальные животные
с использованием MASCOT (matrixscience.com)
Белые беспородные мыши предоставлены пи-
для доступа к базе данных NCBI (Националь-
томником Рапполово, Ленинградская область. Вес
ный центр биотехнологической информации,
животных 16–18 г.
www.ncbi.nlm.nih.gov), в параметрах в качестве
Животных содержали в стандартных условиях
переменных модификаций было указано окисле-
в соответствии с методическими документами,
ние метионинов. Ошибка определения массы была
используемыми при работе. Все процедуры с жи-
ограничена до 50 ppm.
вотными в исследовании были рассмотрены и ут-
верждены Комиссией по биоэтике ФГБУ "НИИ Условия гидролиза пептидазами
гриппа им. А.А. Смородинцева" Минздрава Рос- Растворы пептидов ангиотензина I и брадики-
сии на предмет соответствия регулирующим ак- нина смешивались с сывороткой (разбавление в 25
там. раз) и лаважем (без разбавления). Смеси инкуби-
Вирусы гриппа ровались при 37 °С в течение 15, 40 и 60 мин. Ре-
Для работы был использован штамм вируса акция останавливалась добавлением аликвот в 2 %
гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), адаптированный ТФУ. В анализируемые пробы вносился стандарт
к мышам, полученный из рабочей коллекции ви- ожидаемого продукта гидролиза 18О-ангиотен-
русов ФГБУ "НИИ гриппа им. А.А. Смородинце- зин II для ангиотензина I или 18О-брадикинина для
ва" Минздрава России. брадикинина.
Введение препарата животным
Препарат "Триазавирин" был использован в до- РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТА
зировке 200 мг/кг, вводился перорально в объеме И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
0.2 мл один раз в сутки по лечебно-профи-
лактической схеме (за 24, за 1 ч и через 24, 48 Общая характеристика
и 72 ч после заражения).
В настоящей работе исследовались образцы
Заражение животных и забор проб сыворотки крови и бронхиальных смывов здоро-
Мышей заражали интраназально под легким вых и больных мышей. Выбор этих двух биологи-
эфирным наркозом вирусом в дозе 1 МЛД50 на ческих сред для сравнительных исследований об-
мышь в объеме 50 мкл (МЛД — мышиная леталь- условлен тем, что они позволяют выявить измене-
ная доза). На 3-й день после заражения, через 2 ч ния как в составе крови, так и в легких. В резуль-
после введения препарата животных подвергали тате экспериментов на животных анализировались
НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 1КОЛИЧЕСТВЕННАЯ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ 57
изменения активности протеаз, которые характе- Масс-спектрометрический контроль
ризуют состояние животных при развитии инфек- за гидролизом ангиотензина I
ции и в процессе лечения гриппа препаратом ангиотензинконвертирующим ферментом
"Триазавирин". в сыворотке и лаваже
В данной работе для нормировки активности На рис. 1 представлены масс-спектры началь-
ферментов в бронхиальных смывах использовался ного гидролиза ангиотензина I в бронхиальных
альбумин, количество которого было определено смывах. Показано образование ангиотензина II
по указанной методике [4, 5], а для измерения ак- (m/z = 1046.6) из внесенного в сыворотку ангио-
тивности карбокспептидаз использовались при- тензина I (m/z = 1296.8) под действием АПФ. Вид-
родные субстраты — ангиотензин I и брадикинин. но, что при этом в образце отсутствуют продукты
гидролиза, не характерные для АПФ.
m/z
Рис. 1. MALDI-MS ангиотензина I (m/z = 1296.8) через 40 мин гидролиза
пептидазами в лаваже мыши при 37 °С в присутствии стандарта (m/z =
= 1052.7) к ангиотензину II (m/z = 1046.6)
а
б Рис. 2. Фрагменты масс-спектров для ангио-
тензина II и его стандарта в биологических
средах.
а — в сыворотках, б — в бронхиальных смы-
вах
m/z
НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 158 А. В. ПРОТАСОВ, Р. А. БУБЛЯЕВ, О. А. МИРГОРОДСКАЯ
Рис. 3. Активность АПФ в сыворотках (а) и бронхиальных смывах (б) мышей.
За 100 % взята активность АПФ у здоровых мышей
На рис. 2 представлены фрагменты масс-спек- Масс-спектрометрический контроль
тров гидролизатов для сыворотки (а) и лаважа (б), за гидролизом брадикинина
из которых было рассчитано количество обра- в сыворотке и лаваже
зующегося ангиотензина II, согласно описанной
в работе [5] методике. Количественный масс-спектрометрический кон-
Полученные данные использовались для вы- троль за концентрацией брадикинина, привнесен-
числения относительной активности АПФ. Ре- ного в сыворотку крови и в лаваж, позволил оце-
зультаты этих вычислений представлены на рис. 3. нить изменение протеолитической активности при
Из рисунка видно, что разница в активности АПФ вирусной инфекции по сравнению с контролем.
в сыворотке не столь существенна (разница между Аналогично описанному выше исследованию
здоровой и зараженной особью не превысила по ангиотензину I проведены исследования актив-
20 %) в отличие от результатов, наблюдаемых на ности пептидаз в отношении брадикинина. На
бронхиальных смывах (увеличение активности рис. 4 и 5 представлены результаты исследований
АПФ в 8 раз у инфицированных мышей и сущест- гидролиза брадикинина (продукты гидролиза
венное снижение при приеме препарата практиче- представлены в таблице) в сыворотке и в лаваже.
ски до нормальных значений).
Рис. 4. MALDI-MS брадикинина че-
рез 15 мин гидролиза пептидазами
в сыворотке крови при 37 °С
m/z
НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 1КОЛИЧЕСТВЕННАЯ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ 59
а
б
Рис. 5. Фрагменты масс-спектров для бра-
дикинина и его стандарта в биологиче-
ских средах.
а — в сыворотках, б — в бронхиальных
смывах
m/z
Аминокислотные последовательности продуктов гидролиза брадикинина
Пептид Аминокислотная последовательность
Br(1–9) — брадикинин Apг-Про-Про-Гли-Фен-Сер-Про-Фен-Apг
Br(1–8) Apг-Про-Про-Гли-Фен-Сер-Про-Фен
Br(1–7) Apг-Про-Про-Гли-Фен-Сер-Про
Br(1–5) Apг-Про-Про-Гли-Фен
Рис. 6. Активность пептидаз в сыворотках (а) и бронхиальных смывах (б).
За 100 % взята активность пептидаз у здоровых мышей
Из данных экспериментов прежде всего следу- ролиза брадикинина ангиотензинпревращающим
ет, что при гидролизе брадикинина (Br(1–9)) обра- ферментом.
зуется несколько продуктов. Пептид Br(1–8) мо- Относительная активность пептидаз по отно-
жет быть образован исключительно под воздейст- шению к брадикинину представлена на рис. 6.
вием карбоксипептидазы N. В то же время пепти- Концентрация брадикинина оценивалась с исполь-
ды Br(1–7) и Br(1–5) могут быть продуктами гид- зованием в качестве стандарта 18О-брадикинина.
НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 160 А. В. ПРОТАСОВ, Р. А. БУБЛЯЕВ, О. А. МИРГОРОДСКАЯ
ВЫВОДЫ 3. Гуреева Т.А., Кугаевская Е.В., Позднев В.Ф., Прозо-
ровский В.Н., Елисеева Ю.Е., Соловьева Н.И. Иссле-
Наиболее значимые изменения активности пеп- дование специфичности нового пептидного субстрата
тидаз происходят в бронхиальных смывах, нежели эндотелин-превращающего фермента // Биомедицин-
в сыворотках крови больных животных. ская химия. 2007. Т. 53, № 2. С. 172–180.
Введение препарата здоровому животному 4. Бубляев Р.А., Козьмин Ю.П., Краснов Н.В., Манойлов А.В.,
приводит к увеличению активности АПФ, но в зна- Миргородская О.А., Новиков А.В. Способ получения
чительно меньшей степени по сравнению с инфи- изотопно-модифицированных пептидов и белков. Па-
цированными животными. тент РФ № 2399627. 2008.
При введении препарата больным животным 5. Козьмин Ю.П., Манойлов А.В., Серебрякова М.В.,
происходит заметное снижение активности АПФ Миргородская О.А. Прямое введение изотопов 18О
в пептиды и белки для количественного анализа мето-
до уровня, соответствующего здоровым живот-
дом масс-спектрометрии // Биоорганическая химия.
ным. Это говорит об избирательности воздействия 2011. Т. 37, № 6. С. 793–806.
препарата на ренин-ангиотензиновую систему.
По результатам работы можно сделать общий
вывод о том, что подобный скрининг может быть
с успехом использован при сравнительной оценке
эффективности и других антигриппозных препа- Научно-исследовательский институт гриппа
ратов, а также для понимания направления их воз- им. А.А. Смородинцева Минздрава России, Санкт-
действия на инфицированный организм. Петербург (Протасов А.В., Миргородская О.А.)
Авторы заявляют, что у них нет конфликта инте-
ресов, в том числе и финансовых. Институт аналитического приборостроения РАН,
Данная работа частично выполнена в рамках НИР Санкт-Петербург (Бубляев Р.А.)
0074-2019-0009, входящей в состав гос. задания № 075-
00780-19-02 Министерства науки и высшего образова-
ния Российской Федерации для ИАП РАН.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Контакты: Бубляев Ростислав Анатольевич,
Bub-slava@yandex.ru
1. Pellacani A., Brunner H.R., Nussberger J. Plasma kinins
increase after angiotensin-converting enzyme inhibition in
human subjects // Clin Sci. 1994. Vol. 87, no. 5. P. 567–
574. DOI: 10.1042/cs0870567
2. Chandrasoma P., Taylor C.R. Concise Pathology. 3rd ed.
Материал поступил в редакцию 12.02.2020
Appleton & Lange, 1997. 990 p.
НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2020, том 30, № 1ISSN 0868–5886 NAUCHNOE PRIBOROSTROENIE, 2020, Vol. 30, No. 1, pp. 55–61
QUANTITATIVE MASS SPECTROMETRY IN DIAGNOSTICS
OF INFLUENZA AND CONTROL OF ACTION OF THE MEDICINAL
PRODUCT "TRIAZAVIRINE"
A. V. Protasov1, R. A. Bublyaev2, O. A. Mirgorodskaya1
1
Smorodintsev Research Institute of Influenza of Ministry of Health of the Russian Federation,
Saint Petersburg, Russia
2
Institute for Analytical Instrumentation of RAS, Saint Petersburg, Russia
To improve the methods for diagnosing and treating influenza, we performed quantitative mass spectrome-
tric studies of the activity of two main carboxypeptidases — angiotensin-converting enzyme and carboxypepti-
dase-N. The comparison of activity levels of these peptidases was carried out for mice both healthy and influen-
za A/Aichi/2/68 (H3N2) virus infected, as well as for treated with the experimental triazavirin anti-influenza
drug. An analysis similar to the fulfilled in this work can be successfully used in a comparative assessment of
the effectiveness of other anti-influenza drugs, as well as to understand the direction of their effect on the in-
fected organism.
Keywords: angiotensin I, angiotensin converting enzyme, carboxypeptidase-N, bradykinin, quantitative mass spectrometry
REFERENСES [Biomedical chemistry], 2007, vol. 53, no. 2, pp. 172–
180. DOI: 10.1134/S1990750807030055
1. Pellacani A., Brunner H.R, Nussberger J. Plasma kinins 4. Bublyaev R.A., Koz'min Yu.P., Krasnov N.V., Manojlov A.V.,
increase after angiotensin-converting enzyme inhibition in Mirgorodskaya O.A., Novikov A.V. Sposob polucheniya
human subjects. Clin Sci., 1994, vol. 87, no. 5, pp. 567– izotopno-modifizirovannych peptidov i belkov [A method
574. DOI: 10.1042/cs0870567 of producing isotopically modified peptides and proteins].
2. Chandrasoma P., Taylor C.R. Concise Pathology. 3rd ed. Patent of RF № 2399627. 2008. (In Russ.).
Appleton & Lange, 1997. 990 p. 5. Koz'min Yu.P., Manojlov A.V., Serebryakova M.V., Mir-
3. Gureeva T.A., Kugaevskaya E.V., Pozdnev V.F., Prozo- gorodskaya O.A. [Direct introduction of 18О isotopes into
rovskij V.N., Eliseeva Yu.E., Solov'eva N.I. [The study of peptides and proteins for quantitative analysis by mass
substrate specificity of a new peptide substrate of endothe- spectrometry]. Bioorganicheskaya himiya [Bioorganic
lin-converting enzyme]. Biomedicinskaya himiya chemistry], 2011, vol. 37, no. 6, pp. 793–806. (In Russ.).
Contacts: Bublyaev Rostislav Anatol'evich,
bub-slava@yandex.ru Article received by the editorial office on 12.02.2020
61Вы также можете почитать
