Технология ДНК-биочипов в анализе генетических маркеров болезни Паркинсона
←
→
Транскрипция содержимого страницы
Если ваш браузер не отображает страницу правильно, пожалуйста, читайте содержимое страницы ниже
Болезнь Паркинсона и расстройства движений
Технология ДНК-биочипов в анализе
генетических маркеров болезни Паркинсона
М.И. Шадрина 1, Е.В. Филатова 1, Т. Никопенсиус 2, И.А. Иванова-Смоленская 3,
С.Н. Иллариошкин 3, С.А. Лимборская 3
Института молекулярной генетики РАН (Москва);
1
2
Институт молекулярной и клеточной биологии Тартуского Университета (Тарту);
3
Научный центр неврологии РАМН (Москва)
Для широкомасштабного анализа спектра точковых мутаций и полиморфизмов в генах, вовлеченных в патоге-
нез болезни Паркинсона (БП), нами была использована ДНК-чиповая технология. При создании чипа были вы-
браны наиболее часто (более чем в двух семьях) встречающиеся точковые мутации в генах моногенных форм БП
и целый ряд однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП), расположенных в генах, вовлечённых в патогенез данного
заболевания. Таким образом, мы проанализировали 68 точковых мутаций и 29 ОНП в генах PARK2, PARK7,
LRRK2, PINK1, STH/Tau haplotype, MAPT, UCHL1, NR4A2 (NURR1), PSEN1, SNCB. Необходимо отметить, что
большинство мутаций и ОНП, представленных на чипе, располагается в генах PARK2 и LRRK2, что составляет
соответственно более 58% и 19% от всех мутаций и ОНП на чипе.
Работа проводилась на двух выборках пациентов с БП с ранним началом развития, поскольку считается, что
именно у этой группы пациентов генетический фактор в развитии заболевания выражен сильнее. Именно поэтому
в первую выборку вошёл 21 пациент с ювенильной формой БП (возраст начала до 25 лет), наследуемой по ауто-
сомно-рецессивному типу. Выбор именно этих пациентов для анализа точковых мутаций и ОНП объясняется боль-
шой представленностью на чипе точковых мутаций гене PARK2, которые приводят к развитию именно
ювенильного паркинсонизма. Во вторую выборку вошёл 41 пациент со спорадической формой БП с ранним на-
чалом развития (от 26 до 45 лет) – в генезе этих случаев также предполагается большой вклад мутаций PARK2.
Из 68 изученных нами точковых мутаций мы обнаружили только три различных миссенс- мутации в гетерози-
готном состоянии в гене PARK2 у трёх различных пациентов со спорадической БП с ранним началом развития.
Ранее было показано, что эти три миссенс-мутации (M1L, A82G и C253Y) в гене PARK2 приводят в гомозиготном
состоянии к развитию ювенильной формы БП с наследованием по аутосомно-рецессивному типу [4, 11, 12]. Таким
образом, частота проанализированных нами точковых мутаций в гене PARK2 у больных с ранними формами БП
(из российской популяции составила 5%.
Нам также удалось выявить 12 ОНП (из 29 представленных на чипе) в генах PARK2, NR4A2, LRRK2 и PARK7.
Частоты генотипов выявленных ОНП отражены в таблице 22. Для оценки возможного вклада выявленных нами
ОНП в развитие БП мы провели сравнительный анализ распределения генотипов по этим ОНП в центрально-ев-
ропейской популяции (данные по популяции CEU, central Europe, из проекта по картированию гаплотипов
HapMap) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) с полученными нами результатами (таблица 1).
Таблица 1. Частоты генотипов и аллелей выявленных ОНП.
Генотипы и аллели по ОНП Европейская популяция Пациенты с ювенильной формой Пациенты со спорадической фор-
БП из России мой БП из России
PARK2
S167N (rs1801474) (GG/GA/AA) 0,967/0,033/0 0,952/0,048/0 0,951/0,049/0
V380L (rs1801582) (CC/CG/GG) 0,683/0,300/0,017 0,81/0,19/0 0,927/0,073/0
D394N (rs1801334) (CC/CT/TT) 0,883/0,117/0 1/0/0 0,902/0,098/0
14 Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫСекция 1. Болезнь Паркинсона
Генотипы и аллели по ОНП Европейская популяция Пациенты с ювенильной формой Пациенты со спорадической фор-
БП из России мой БП из России
NR4A2 (NURR1)
N16PinsG (AA/AG/GG) Нет данных 0,524/0,476/0 0,634/0,366/0
LRRK2
N551K (rs7308720) (CC/CG/GG) 0,883/0,117/0 0,952/0,048/0 0,927/0,073/0
P1542S (rs33958906) Нет данных 0,762/0,238/0 0,805/0,195/0
(CC/CT/TT)
L153L (rs10878245) (CC/CT/TT) 0,367/0,467/0,167 0,667/0,333/0 0,366/0,341/0,293
I723V (rs10878307) (AA/AG/GG) 0,833/0,150/0,017 1/0/0 0,927/0,073/0
rs7966550 (TT/TC/CC) 0,750/0,200/0,050 0,952/0,048/0 0,951/0,049/0
R1514Q (rs35507033) G = 0,980; G = 0; G = 0,976;
(G/A) A = 0,020 (24) A=0 A = 0,024
S461S (rs35847451) Нет данных 0,952/0,048/0 0,976/0,024/0
(TT/TC/CC)
PARK7 (DJ-1)
R98Q G = 0,980; G = 0,976; G = 0,988;
(rs71653619) A = 0,020 A = 0,024 A = 0,012
(GG/GA/AA)
Как видно из таблицы 1, частоты, как аллелей, так и генотипов большинства выявленных нами ОНП в проана-
лизированных выборках больных БП из России совпадают с таковыми в популяции Центральной Европе (CEU).
Только для двух ОНП – rs1801582 (V380L) и rs7966550 в генах PARK2 и LRRK2, выделенных в таблице 1 жирным
шрифтом, были обнаружены отличия в распределении генотипов между данными выборками. Следовательно,
можно предположить, что эти два ОНП в генах LRRK2 и PARK2 (rs7966550 и rs1801582 (V380L), соответственно)
могут влиять на риск развития БП в российской популяции. В связи с этим был проведен анализ данных ОНП на
более представительной выборке больных со спорадической формой БП и в популяционной выборке. Результаты
более детального анализа ОНП rs1801582 и rs7966550 в генах LRRK2 и PARK2 представлены в таблице 2.
Как видно из представленных данных, частоты и аллелей, и генотипов по обоим ОНП rs1801582 (PARK2) и
rs7966550 (LRRK2) у больных со спорадической формой БП совпадают с таковыми в популяционной выборке.
Таким образом, проведённый нами более детальный анализ не подтвердил наличие ассоциаций ОНП rs1801582 и
rs7966550 в генах PARK2 и LRRK2 с БП.
Согласно данным полногеномных исследований ассоциаций для двух генов − SNCA и MAPT− были выявлены
строгие ассоциации с БП практически во всех исследованиях [5]. В связи с этим мы также решили провести анализ
ОНП расположенных в этих генах. Были выбраны по одному ОНП в гене SNCA и в гене WNT3, расположенном
рядом с геном MAPT – rs2736990 и rs415430 соответственно [13]. Полиморфизм rs2736990 расположен в самом
длинном интроне гена SNCA, и, вероятно, может влиять на регуляцию экспрессии этого гена. Функция гена WNT3
пока неизвестна, но белок, кодируемый этим геном, относят к семейству секретируемых сигнальных белков, при-
нимающих участие в некоторых процессах при эмбриогенезе [7]. Однако, несмотря на то, что полиморфизм
rs415430 расположен в гене WNT3 его ассоциируют с локусом гена MAPT.
Результаты, полученные нами в ходе этого этапа работы, представлены в таблице 3. Как видно из представлен-
ных данных, наличие аллеля С в ОНП rs2736990 в гене SNCA достоверно повышает риск развития БП. Таким об-
разом, нам удалось показать чёткую ассоциацию полиморфизма rs2736990 в гене SNCA с риском развития
спорадической формы БП в российской популяции. Мы получили соотношение шансов OR = 1,75 (ДИ95% = 1,19
2,58; p = 0,004), что отражает повышение риска развития БП у носителей аллеля С почти в два раза. [3, 13].
Как уже было упомянуто раньше, в локусе гена MAPT были выявлены различные ОНП, влияющие на риск раз-
вития БП. Тем не менее, несмотря на обнадёживающие результаты Simon-Sanchez и др. [13], нам не удалось вы-
явить ассоциацию полиморфизма rs415430 в гене WNT3 с риском развития БП в российской популяции.
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ 15Болезнь Паркинсона и расстройства движений
Таблица 2. Частоты аллелей и генотипов ОНП в генах LRRK2 и PARK2.
АЛЛЕЛИ ГЕНОТИПЫ Отношение P value
N (%) N (%) шансов (95%
доверительный
интервал (CI))
LRRK2 rs7966550 Т С ТТ ТС СС
Спорадические больные с ран- 227 (88,7%) 29 (11,3%) 101 (78,8%) 25 (19,5%) 2 (1,6%) 0,87 (0,51-1,51) 0,62
ним началом развития БП
Спорадические больные с 327 (89,3%) 39 (10,7%) 146 (79,8%) 35 (19,1%) 2 (1,1%) 0,84 (0,51-1,38) 0,49
поздним началом развития БП
Общая выборка спорадических 554 (89,1%) 68 (10,9%) 247 (79,4%) 60 (19,3%) 4 (1,3%) 0,85 (0,55-1,31) 0,47
больных БП
Популяционная выборка 386 (87,7%) 54 (12,3%) 169 (77,2%) 48 (21,9%) 2 (0,9%) - -
PARK2 rs1801582 G C GG GC CC
Спорадические больные с ран- 210 (79,6%) 54 (20,4%) 82 (62,1%) 46 (34,9%) 4 (3,0%) 1,21 (0,78-1,97) 0,36
ним началом развития БП
Спорадические больные с 314 (85,8%) 52 (14,2%) 133 (72,7%) 48 (26,2%) 2 (1,1%) 0,79 (0,51-1,24) 0,31
поздним началом развития БП
Общая выборка спорадических 524 (83,2%) 106 (16,8%) 215 (68,3%) 94 (29,8%) 6 (1,9%) 0,96 (0,66-1,41) 0,96
больных БП
Популяционная выборка 363 (81,4%) 83 (18,6%) 148 (66,4%) 67 (30,0%) 8 (3,6%) - -
Таблица 3. Частоты аллелей и генотипов ОНП в генах SNCA и MAPT/WNT3 .
АЛЛЕЛИ ГЕНОТИПЫ Отношение P value
N (%) N (%) шансов (95%
доверительный
интервал (CI))
SNCA rs273699 C T CC CT TT (CC+CT)/TT
Спорадические больные с ран- 149 (55,7%) 116 (44,3%) 44 (33,6%) 58 (44,3%) 29 (22,1%) 1,77 (1,05-2,85) 0,03
ним началом развития БП
Спорадические больные с 181 (49,5) 185 (50,5%) 38 (20,8%) 105 (57,4%) 40 (21,8%) 1,74 (1,05-2,76) 0,01
поздним началом развития БП
Общая выборка спорадических 327 (52,1%) 327 (52,1%) 301(47,9%) 163 (51,9%) 69 (22,0%) 1,75 (1,19-2,58) 0,004
больных БП
Популяционная выборка 198 (44,2%) 250 (55,8%) 48 (21,4%) 102 (45,6%) 74 (33,0%) - -
MAPT/WNT3 rs 415430 A G AA AG GG (AA+AG)/GG
Спорадические больные с ран- 232 (87,2%) 34 (12,8%) 100 (75,2%) 32 (24,1%) 1 (0,7%) 0,19 (0,008- 0,19
ним началом развития БП 4,87)
Спорадические больные с 326 (89,1%) 40 (10,9%) 145 (79,2%) 36 (19,7%) 2 (1,1%) 0,16 (0,008- 0,11
поздним началом развития БП 3,39)
Общая выборка спорадических 558 (88,3%) 74 (11,7%) 245 (77,5%) 68 (21,5%) 3 (1,0%) 0,87(0,14-5,24) 0,87
больных БП
Популяционная выборка 402 (89,7%) 46 (10,3%) 178 (79,5%) 46 (20,5%) 0 (0%) - -
16 Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫСекция 1. Болезнь Паркинсона
Одним из наиболее распространенных на сегодняшний день подходов для поиска новых генов и ДНК марке-
ров, влияющих на риск развития мультифакторильных заболевания, является анализ ассоциаций с использованием
чиповых технологий. При этом используются ДНК-чипы, позволяющие анализировать, как полиморфные вари-
анты в целом геноме, так полиморфные варианты в ограниченном числе генов, связанных с определенными ме-
таболическими путями.
Для поиска новых генов-кандидатов и ДНК-маркеров, которые могут быть вовлечены в патогенез БП, нами был
выбран чип, содержащий 50 ОНП в 19 генах, белки которых вовлечены в передачу нервного импульса (таблица 4).
Таблица 4. Гены-кандидаты, представленные на ДНК-чипе.
ГЕН ОНП
Ген холецистокинина (ССK) 2
Ген рецептора холецистокинина А (CCKAR) 3
Ген рецептора холецистокинина В (CCKBR) 4
Ген рецептора дофамина 1 (DRD1) 5
Ген рецептора дофамина 2 (DRD2) 6
Ген рецептора дофамина 3 (DRD3) 3
Ген рецептора дофамина 4 (DRD5) 1
Ген тирозингидролазы (TH) 1
Ген рецептора серотонина 1А (HTR1A) 1
Ген рецептора серотонина 1В (HTR1B) 3
Ген рецептора серотонина 2А (HTR2A) 3
Ген рецептора серотонина 2С (HTR2C) 1
Ген транспортера дофамина (SLC6A4) 1
Ген триптофангидролазы 1 (TPH1) 2
Ген опиоидного рецетора µ (OPRM1) 3
Ген опиоидного рецетора δ (OPRD1) 2
Ген проопиомеланокартина (POMC) 3
Ген проэнкефалина (PENK) 1
Ген вольфрамина (WFS1) 6
Было проанализировано 97 пациентов со спорадической формой БП с поздним началом развития (средний воз-
раст 60,1 ± 12,3 лет). В отобранную группу больных не включались больные с идентифицированными мутациями
в генах PARK2 и LRRK2. Контрольную группу составили 100 индивидуумов из популяционной выборки, не стра-
дающих неврологическими заболеваниями, соответствующих по полу, возрасту обследованной группе больных БП.
При анализе полученных результатов было обнаружено, что распределение генотипов и аллелей для 4 ОНП,
расположенных в трех различных генах, отличается между выборкой спорадических больных БП и популяцион-
ным контролем (таблица 5).
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ 17Болезнь Паркинсона и расстройства движений
В гене рецептора серотонина типа 2A (HTR2A) было проанализировано три ОНП, но только для одного из них
– rs6311 (–1438G/A) была выявлена ассоциация с БП у наших больных. Было показано, что носительство аллеля
А повышает риск развития БП почти в два раза (OR=1,81, ДИ 95% = 1,05 3,24, p =0,04) (таблица 5). Рецептор се-
ротонина типа 2A играет важную роль в обмене серотонина дисбаланс которого может привести к нарушению об-
мена дофамина в стриатуме. Было так же показано, что связывание лигандов с рецептором серотонина 2А
препятствует синаптическому выбросу дофамина, оказывая тем самым негативное воздействие на дофаминерги-
ческие нейроны [10]. Кроме того, в нейрохимических исследованиях было установлено, что у больных БП наблю-
дается снижение концентрации серотонина в стриатуме, коре и цереброспинальной жидкости [1]. В ряде
исследований проведенных ранее была выявлена ассоциация БП с полиморфизмами в генах рецептора серотнина
типа 6 (HTR6) и транспортера серотонина SLC6A4 [8, 9]. При анализе спорадических больных из России было из-
учено шесть генов (HTR1A, HTR1B, HTR2А, HTR2C, SLC6A4), вовлеченных в обмен серотонина. Для одного из
них, гена HTR2A, была выявлена ассоциация БП с полиморфизмом rs6311 (–1438G/A). Эти данные позволяют
предположить, что рецептор серотонина типа 2A может играть роль в патогенезе БП в российской популяции.
Еще одна ассоциация с БП в российской популяции была выявлена для одного из 6 исследованных ОНП в гене
вольфрамина (WFS1) – rs1801211 (C1645T), расположенного в экзоне 8. Было обнаружено, что у лиц имеющих ал-
лель Т, риск развития БП повышен более чем в два раза (OR=2,34, ДИ95%=1,29 4,24, p =0,005). Как известно, му-
тации гена WFS1 обусловливают развитие редкого аутосомно-рецессивного нейродегенеративного заболевания –
вольфрам-синдрома, характеризующегося диабетом, атрофией зрительного нерва и нейросенсорной тугоухостью
[6]. Белковый продукт гена, вольфрамин, является мембранным гликопротеином эндоплазматического ретикулума
и предположительно участвует в формировании синаптических везикул [14]. Полученные нами данные, позволяют
предположить, что ОНП rs1801211 гена WFS1 может влиять на риск развития БП в российской популяции.
В гене проопиомеланокортина РОМС было проанализировано три ОНП – rs28930368 (C282T), rs2071345
(C585T), расположенные в кодирующей области экзона 3, и полиморфизм rs1042571 (С866Т), расположенный в
3’-нетранслируемой области. Для двух ОНП, расположенных в кодирующей области экзона 3 гена РОМС была
выявлена ассоциация с БП.
Было установлено, что наличие аллеля Т по обоим ОНП повышает риск развития заболевания в 5 раз (OR=5,0,
ДИ 95%=1,05 23,83, p =0,03) в российской популяции (таблица 5).
Следовательно, полученные данные еще раз подтверждают, что носительство аллеля Т по ОНП rs28930368
(C282T) и ОНП rs2071345 (C585T) в гене РОМС значительно повышает риск развития БП в российской популяции.
Кроме того был проведен поиск корреляций между различными генотипами по ОНП rs28930368 (C282T) и
ОНП rs2071345 (C585T) в гене РОМС и различными клиническими характеристиками больных. Корреляционный
анализ проводился с использованием ранговой корреляции по Спирмену, и для обоих ОНП в гене РОМС была
выявлена одинаковая корреляция с одним клиническим признаком – формой заболевания (Коэффициенты ран-
говой корреляции по Спирмену для ОНП rs28930368 (C282T) – 0, 24 и для ОНП rs2071345 (C585T) – 0,25.
С целью более детального анализа выявленной корреляции и оценки влияния «неблагоприятных» аллелей ис-
следованных ОНП были произведены следующие модификации:
• все больные были подразделены на 2 подгруппы: 1) группа больных с преобладанием тремора (n=61), в ко-
торую вошли больные с дрожательной и дрожательно-ригидной формой БП; 2) группа больных с преобла-
данием мышечной ригидности (n=36), в которую вошли больные с акинетико-ригидной и
ригидно-дрожательной формой.
• гетерозиготы и гомозиготы по аллелям Т для обоих ОНП были объединены в единый (комбинированный)
генотип.
Для обоих полиморфизмов были обнаружены идентичные корреляции между формой болезни и комбиниро-
ванным генотипом (гамма-корреляция: Гамма=0,5787, Z=2,8532, P=0,0043 для rs28930368 (C282T) и Гамма=0,5893,
Z=2,8967, P=0,0038 для rs2071345 (C585Т)). При этом у больных с преобладанием мышечной ригидности имело
место значимое повышение частоты комбинированного генотипа CT+TT (частота = 0,78) – одинаковое для обоих
ОНП, тогда как у пациентов с преобладанием тремора – гомозиготного СС-генотипа (частота = 0, 68), также оди-
наковое для обоих ОНП.
Таким образом, можно утверждать, что два полиморфизма в кодирующей области гена POMC ассоциированы
с БП: носители редкого Т-аллеля по обоим SNP имеют достоверно более высокий риск БП, а наличие этого аллеля
у пациентов коррелирует с развитием более тяжелой ригидной формы БП. Функциональная роль указанных по-
лиморфизмов неясна. Эти ОНП приводят к синонимическим заменам S94S (rs28930368 (C282T)) и А195A
(rs2071345 (C585Т)) и вряд ли могут влиять непосредственно на риск развития БП. Однако эти замены могут быть
сцеплены с каким-либо другим функционально значимым вариантом, непосредственно влияющим на риск раз-
вития БП. Белок проопиомеланокортин является предшественником большого числа регуляторных пептидов,
включая адренокортикотропный гормон (АКТГ) и α-меланотропин. Проведенные нами исследования показали,
что пептидный препарат семакс, являющийся синтетическим аналогом АКТГ(4−10), может изменять экспрессию
мРНК мозгового нейротрофического фактора (BDNF) как в первичных глиальных клетках мозга новорожденных
крыс, так в нейронах гиппокампа и лобной коры. Кроме того было установлено, что α-меланотропин может по-
вышать экспрессию мРНК BDGF и в нейронах среднего мозга крыс [2]. АКТГ и α-меланотропин кодируются
последовательностью экзона 3, в которой расположены ассоциированные с БП полиморфизмы. Известно также,
18 Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫСекция 1. Болезнь Паркинсона
Таблица 5. Частоты аллелей и генотипов ОНП в генах HTR2A, WFS1, POMC.
АЛЛЕЛИ ГЕНОТИПЫ Отношение P value
N (%) N (%) шансов (95%
доверительный
интервал (CI))
HTR2A rs6311 G A GG GA AA GG/(GA+AA)
Спорадические больные с 113 (58,2%) 81 (41,8%) 31 (31,9%) 51 (52,6%) 15 (15,5%) 1,81 (1,05-3.24) 0,04
поздним началом развития БП
Популяционная выборка 135 (67,5%) 65 (32,5%) 46 (46,0%) 43 (43,0%) 11 (11,0%) -
WFS1 rs1801211 C T CC CT TT CC/(CT+TT)
Спорадические больные с 147 (75,8%) 47 (24,2%) 52 (53,6%) 43 (43,4%) 2 (2,1%) 2,34 (1,29-4,24) 0,005
поздним началом развития БП
Популяционная выборка 173 (86,5%) 27 (13,5%) 73 (73,0%) 27 (27,0%) 0 (0,0%) -
POMC rs28930368 C T CC CT TT CC/(CT+TT)
Спорадические больные с 180 (92,8%) 14 (7,2%) 88 (90,7%) 4 (4,1%) 5 (5,2%) 5,01 (1,05- 0,03
поздним началом развития БП 23,83)
Популяционная выборка 197 (98,5%) 3 (1,5%) 98 (98,0%) 1 (1,0%) 1 (1,0%) -
POMC rs2071345 C T CC CT TT CC/(CT+TT)
Спорадические больные с 178 (91,7%) 16 (0,3%) 88 (91,7%) 2 (2,1%) 7 (7,2%) 5,01 (1,05- 0,03
поздним началом развития БП 23,83)
Популяционная выборка 194 (99,0%) 2 (1,0%) 96 (98,0%) 2 (2,0%) 0 (0,0%) -
что РОМС как нейропептид ответственен за пролиферацию, дифференцировку и выживание нейронов. Эти дан-
ные, возможно, частично объясняют выявленную ассоциацию между полиморфизмами гена РОМС и БП.
Суммируя полученные нами результаты можно предположить, что ген РОМС играет роль в патогенезе спора-
дической БП и является новым геном-кандидатом данного заболевания. Можно также предположить, что ген
РОМС являться геном модификатором, в определенной степени ответственным за фенотипическую вариабель-
ность БП в российской популяции.
Литература
1. D’Amato R.J., Zweig R.M., Whitehouse P.J. et al. Aminergic systems in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. Ann. Neurol. 1987; 22: 229–236.
2. Dolotov O.V., Seredenina T.S., Levitskaya N.G. et al. The heptapeptide SEMAX stimulates BDNF expression in different areas of the rat brain in vivo. Dokl. Biol. Sci. 2003; 391: 292-297.
3. Edwards T.L., Scott W.K., Almonte C. et al. Genome-wide association study confi rms SNPs in SNCA and the MAPT region as common risk factors for Parkinson disease. Ann. Hum. Genet.
2010; 74: 97–109.
4. Hedrich K., Kann M., Lanthaler A.J. et al. The importance of gene dosage studies: mutational analysis of the parkin gene in early-onset parkinsonism. Hum Mol Genet. 2001; 10: 1649-1656.
5. International Parkinson Disease Genomics Consortium. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association
studies. Lancet 2011; 377: 641-649.
6. Khanim F., Kirk J., Latif F., Barrett T.G. WFS1/wolframin mutations Wolfram syndrome, and associated diseases. Hum. Mutat. 2001; 17: 357–367.
7. Liu P., Wakamiya M., Shea M.J. et al. Requirement for Wnt3 in vertebrate axis formation // Nat. Genet. 1999; 22: 361-365.
8. McCann S.J., McManus M.E., Johnson A.G. et al. The serotonin transporter gene and Parkinson's disease. Eur. Neurol. 2000; 44: 108 111.
9. Messina D., Annesi G., Serra P. Association of the 5-HT6 receptor gene polymorphism C267T with Parkinson's disease. Neurology 2002; 58: 828–829.
10. Ng N.K., Lee H.S., Wong P.T. Regulation of striatal dopamine release through 5-HT1 and 5-HT2 receptors. J. Neurosci. Res. 1999; 55: 600–607.
11. Oliveira S.A., Scott W.K., Martin E.R. et al. Parkin mutations and susceptibility alleles in late-onset Parkinson’s disease. Ann. Neur. 2003; 53: 624-629.
12. Rawal N., Periquet M., Lohman E. et al. New parkin mutations and atypical phenotypes in families with autosomal recessive parkinsonism. Neurology 2003; 60: 1378-1381.
13. Simon-Sanchez J., Schulte C., Bras J.M. et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson’s disease. Nat. Genet. 2009; 41: 1308–1312.
14. Takeda K., Inoue K., Tanizawa Y. et al. WFS1 (Wolfram syndrome 1) gene product: predominant subcellular localization to endoplasmic reticulum in cultured cells and neuronal expression in
rat brain. Hum. Mol. Genet. 2001; 10: 477–484.
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ 19Болезнь Паркинсона и расстройства движений
Особенности клинического течения болезни
Паркинсона, ассоциированной с мутациями
в гене LRRK2
А.Ф. Якимовский 1, 3, О.Н. Иванова 1, А.К. Емельянов 1, 2, С.Н. Пчелина 1, 2
1
Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова;
2
Петербургский институт ядерной физики им Б.П. Константинова РАН;
3
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург)
Современная неврология – клиническая и экспериментальная – невозможны без изучения заболеваний ЦНС
на молекулярно-клеточном уровне. Достижения современной генетики позволяют по-новому взглянуть на этио-
логию нейродегенеративных заболеваний, в частности на болезнь Паркинсона (БП). Однако это не отменяет и не
снижает актуальность клинических наблюдений, где невролог, по сути, имеет дело с фенотипом заболевания. Воз-
можность обнаружения взаимосвязи нарушения молекулярного и системного уровней, выявления возможных
корреляций генетических нарушений и особенностей течения БП – один из путей выяснения основ этиопатоге-
неза заболевания.
Нами обследовано более тысячи пациентов с БП и вторичным («симптоматическим») паркинсонизмом. Работа
проводилась при реализации консультативно-диагностических мероприятий в МКДЦ СПбГМУ им. акад. И.П.
Павлова, в клинической группе Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (на базе больницы № 20) и в поли-
клинических отделениях медицинских учреждений города. В этой популяции нами был определен спектр мутаций
в гене LRRK2 среди семейных форм БП, выявлен ряд семей с LRRK2-ассоциированной БП и проведена молеку-
лярная диагностика БП в этих семьях [14, 15]. В ходе исследования нами выявлены как ранее идентифицированные
мутации (G2019S, R1441C) [3, 13], так и новая мутация V1613A, приводящая к развитию БП с преобладающим
тремором [15].
Накопленный материал позволил провести сопоставление фенотипа LRRK2-ассоциированной БП и БП от-
личной этиологии. Целью данной работы было описание возможных особенностей паркинсонизма у 13 пациентов
с мутациями в гене LRRK2 и сопоставление фенотипа LRRK2-ассоциированной БП с группой пациентов с БП, у
которых мутации в гене LRRK2 выявлено не было. Диагноз БП выставлялся при наличии как минимум двух из
четырех признаков паркинсонических нарушений: тремора покоя, ригидности скелетной мускулатуры пластиче-
ского типа, брадикинезии и постуральных нарушений [1, 4]. При необходимости использовались инструменталь-
ные методы, в частности проводилась компьютерная тензо-треморография. В исследование вошли пациенты с
чёткой симптоматикой, установленным диагнозом БП и без других дегенеративных заболеваний головного мозга.
Забор крови для последующего молекулярно-генетического анализа был осуществлен у 330 пациентов (230 спо-
радических случаев, 100 семейных случаев) и 14 родственников (11 с БП и 3 с отсутствием заболевания). У 75 про-
бандов с семейной формой БП проведен полный сиквенс кодирующей области гена LRRK2 [19]. У остальных
пациентов проведен скрининг ряда мутаций в гене LRRK2 (мутации G2019S, R1441C, R1441G) разработанными
нами ранее методами на основе ПЦР и рестрикционного анализа [3, 14]. В настоящем исследовании скрининг
вышеуказанных мутаций был проведен у 25 пациентов с семейной формой БП и у 40 пациентов со спорадической
БП, впервые включенных в исследование.
Большая часть пациентов находилась под нашим наблюдением длительное время (10-15 лет). Для выявления
особенностей клинического течения LRRK2-ассоциированной БП были сформированы две группы сравнения:
13 пациентов с LRRK2-ассоциированной БП (7 муж., 6 жен.; 71,0±9,3 лет (средний возраст ± SD)), а также 80 па-
циентов с течением БП более 7 лет (70,6±5,3 лет) и не имеющих мутаций в гене LRRK2 (далее – группа сравнения).
Группа пациентов с LRRK2-ассоциированной БП и пациенты группы сравнения были сопоставимы по полу, воз-
расту и длительности заболевания. Все они являлись жителями Санкт-Петербурга. Данное исследование одобрено
этическим комитетом СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.
Для сравнения исследуемых характеристик между группами использовался критерий . Сравнение среднего
возраста пациентов проводилось с помощью критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия
при P < 0,05. Средние значения приведены со стандартным отклонением.
Результаты и их обсуждение
В группе пациентов из 100 обследованных семейных случаев БП в шести семьях LRRK2-ассоциированная БП
была выявлена нами ранее [3, 14, 15] и двух семьях (родословные PD6 и PD7) – в настоящем исследовании. Также
два носителя мутаций LRRK2 выявлены среди 230 пациентов со спорадической БП. Таким образом, частота
20 Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫСекция 1. Болезнь Паркинсона
LRRK2-ассоциированной БП среди семейных форм заболевания (8%), значительно выше, чем среди спорадиче-
ских случаев (0,9%).
Таблица 1. Характеристики пробандов-пациентов с БП – носителей мутаций в гене LRRK2.
Симптомы БП на момент начала
Эффективность терапии
Побочные эффекты те-
Симптомы заболевания
Возраст начала заболевания
на момент осмотра
рапии Л-ДОФА
Л-ДОФА
заболевания
Мутации
Пациент
Возраст
Семья
Пол
Т Р Б П.Н.
1 G2019S PD1 м 75 67 Б - + + + Не прини- -
(II-1) мал
2 G2019S PD1* м 53 35 Б,Р + + + + хорошая Психиче-
(III-1) ские изме-
нения
3 G2019S PD2 м 70 50 Т + + + + хорошая нет
(II-1)
4 G2019S PD3* ж 54 39 Б + + + + хорошая Гиперкинез
(III-1)
5 G2019S PD4* м 78 59 Т + + + + хорошая нет
(III-4)
6 G2019S PD5* ж 78 68 Т + - - + Не прини- -
(II-2) мал
7 G2019S PD6 м 72 65 Т + + + + хорошая галлюци-
(II-2) нации
8 G2019S PD7 ж 76 74 Т + + + + Не прини- -
мал
9 G2019S PD7 ж 74 69 Т + + + + хорошая нет
10 V1613A PD8* м 79 60 Т + - - + плохая нет
(II-3)
11 V1613A PD8 ж 79 70 Т + - - + Не прини- -
(II-1) мал
12 G2019S сБП ж 60 47 Р + + + + хорошая Дискинезии
13 R1441C сБП м 75 61 Т + + - + Не прини- -
мал
Обозначения: Т – тремор, Р – ригидность, Б – брадикинезия, П.Н. – постуральная нестабильность, сБП – спорадическая форма,
БП* – пациенты, у которых длительность наблюдения за течение заболевания в настоящем исследовании составили 5-15 лет.
Характеристики пациентов с БП, у которых была обнаружена мутация в гене LRRK2, представлены в таблице 1.
Известно, что тремор покоя вомногих случаях является дебютным признаком БП, после чего добавляются осталь-
ные компоненты триады. Именно эта закономерность обнаружена у данной группы – дебютным признаком тре-
мор был у 9 пробандов. При развитии болезни у 3 из них (23%) он остался единственным признаком (наряду с
нарушением позных реакций), в то время как у 8 пациентов (61%) сформировалась развёрнутая картина БП с клас-
сической триадой. В связи с этим уместно заметить, что симптоматический профиль заболевания в популяции
наших пациентов за 10 лет наблюдений несколько видоизменился. В период 1998-2000 из 230 человек с установ-
ленным диагнозом БП половина (50,4%) имела полный набор симптомов триады, а остальные (с акинетико-ри-
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ 21Болезнь Паркинсона и расстройства движений
гидной и дрожательной формами) распределились примерно поровну. Повторный анализ, охвативший период
2008–2010 г.г. (256 человек) показал, что доля пациентов с акинетико-ригидно-дрожательной формой БП увеличи-
лась (до 55,5%), доля пациентов с акинетико-ригидной формой заметно уменьшилась (до 5,5%), а с дрожательной,
напротив – увеличилась до 39%. В группе сравнения, о которой пойдёт речь ниже (таблица 2), созданной по другим
критериям, обнаружена та же закономерность, что говорит о явной тенденции в целом и о том, что симптомати-
чески группа пациентов с LRRK2-ассоциированной БП практически не отличается от общей популяции и харак-
теризуется гетероморфностью признаков.
Учитывая приведённые факты, рассмотрим основные характеристики клинического течения в семьях пациентов
с LRRK2-ассоциированной БП. Нами выявлено семь семей (родословные PD1–PD7 на рисунке 1), в которых БП
обусловлена наличием мутации G2019S, одна семья с БП, обусловленной мутацией V1613A (PD8), а также два спо-
радических случая с мутациями G2019S и R1441C. В настоящем исследовании при скрининге мутаций LRRK2 среди
дополнительно обследованных 25 пациентов с семейной формой БП в двух семьях выявлена мутация G2019S. В
семье PD6 мутация G2019S выявлена только у пробанда (муж., начало заболевания в возрасте 65 лет). В семье PD7
этаже мутация была обнаружена у пробанда (жен., начало заболевания в возрасте 74 лет) и ее сестры, также больной
БП (начало заболевания в 69 лет). Все трое ранее не описанных пациентов с мутацией G2019S имели БП с класси-
ческой триадой симптомов (акинетико-ригидно-дрожательная форма) с поздним началом заболевания.
Оба пациента с мутацией V1613A (семья PD8 пациенты II-1 II-3) имели вариант течения БП с преобладанием
тремора покоя – в их клинической картине отсутствовала ригидность скелетной мускулатуры пластического типа
и брадикинезия. Несмотря на длительное течение болезни (17 и 19 лет заболевания) у пробанда и его сестры тремор
(наряду с нарушениями в системе позных рефлексов) оставался единственным признаком из триады симптомов
заболевания. Дрожательная форма заболевания зарегистрирована и у ещё одного пациента с мутацией G2019S
(семья PD5, пациент II-2) с длительностью заболевания 10 лет, в то время как остальные пациенты с мутацией
G2019S и R1441C имели классическую картину идиопатической БП с наличием классической триады признаков.
Анализ возраста начала заболевания показал, что в среднем он был ниже у пациентов с мутацией G2019S, локали-
зованной в киназном районе LRRK2 – по сравнению с мутациями, локализованными в других районах, однако
различия между группами не достигали статистической значимости. Проблема «омоложения» действительно акту-
альна и возвращаясь к анализу популяции наших пациентов можно отметить, что основным «поставщиком» забо-
левания – и десять лет назад и сейчас – является возраст 50–69 лет (в этот период заболели, соответственно, 66% и
68% пациентов). Пациенты, заболевшие после 70 лет, составили 14,8% и 15,6%, а вот доля заболевших в 49 лет и
ранее снизилась с 19,2% (т.е. ранний паркинсонизм обнаруживался десять лет назад у каждого пятого) до 16,4%.
Молекулярно-генетическое исследование, проведенное нами в семьях пациентов, оказалось полезным в плане
исключения наследования данного заболевания у некоторых членов семей (родословные PD1–PD3). В то же время
был выявлен один бессимптомный носитель мутации в возрасте 40 лет. Показателен случай, зарегистрированный
в семье PD3, где у пробанда III-1 проявления заболевания в дебюте (больна с 39 лет) были крайне нечёткими, сма-
занными: ригидность мускулатуры отсутствовала, тремор рук был мелким, усиливающимся при пробах на напря-
жение, но не на положение конечности, гипокинезия носила неясный характер. В течение долгого времени диагноз
не выставлялся (фигурировал эссенциальный тремор или амиостатический синдром), пациентка не получала ан-
типаркинсонической терапии, хотя её дееспособность прогрессивно снижалась. При проведении тщательной ди-
агностики в МКДЦ СПбГМУ с последующим назначением фармакотерапии с минимальными дозами Л-ДОФА
(200 мг в сутки) был получен хороший устойчивый результат, существенно улучшивший качество жизни, само-
обслуживание пациентки. Если бы генетическое исследование было проведено раньше (а не в возрасте 49 лет),
сомнения неврологов были бы сняты, и адекватная терапия была бы начата своевременно.
С целью изучения общей клинической картины LRRK2-ассоциированной БП нами проведено сопоставление
возраста начала болезни, симптоматики БП в указанной группе пациентов с ещё одной группой сравнения. В
группу сравнения вошли пациенты с БП, не имеющие мутаций в гене LRRK2, сопоставимые с группой LRRK2-
ассоциированной БП по полу, возрасту и длительности заболевания. При сравнении двух вышеуказанных групп
по формам заболевания и возрасту начала заболевания достоверных отличий не выявлено (таблица 2).
Другой, не менее важной причиной создания дополнительной группы сравнения стало изучение другого акту-
ального клинического вопроса – эффективности лечения, в частности леводопотерапии. Большинство пациентов,
вошедших в наше исследование, проходили комплексную лекарственную антипаркинсоническую терапию (со-
четание холинолитиков, аналогов амантадина, постсинаптических активаторов дофаминовых рецепторов, препа-
ратов Л-ДОФА, ноотропов и проч.). Восемь из 13 пациентов с LRRK2-ассоциированной БП и 46 пациентов из
группы сравнения получали терапию препаратами Л-ДОФА. Суточная доза обычно колебалась в пределах 200 –
800 мг. Положительный ответ на Л-ДОФА (полное купирование или существенное снижение гипокинезии и умень-
шение ригидности мускулатуры) зарегистрирован у 87,5% пациентов с LRRK2-ассоциированной БП и у 78% па-
циентов группы сравнения, что соответствует эффективности, характерной для данной группы препаратов [8].
Семь из восьми пациентов принимающих Л-ДОФА с мутациями в гене LRRK2 имели хороший ответ на прово-
димую терапию. Все они являлись носители мутации G2019S и принимали препараты Л-ДОФА более пяти лет. Сла-
бый ответ на терапию препаратами Л-ДОФА наблюдался у одного пациента с мутацией V1613A с преобладающим
паркинсоническим тремором. Учитывая тот факт, что побочные эффекты препаратов коррелируют с длительностью
их приема, при анализе частоты побочных осложнений от проводимой Л-ДОФА терапии в группу сравнения были
22 Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫСекция 1. Болезнь Паркинсона
Таблица 2. Сопоставление клинического течения БП у лиц с мутациями в гене LRRK2 и у лиц с БП отличной этиологии.
Клинические характеристики па- Пациенты с мутацией в гене Пациенты с БП, c отсутствием P
циентов БП LRRK2 мутации в гене LRRK2 (80 чело-
(13 человек) век)
Мужчины/женщины 7(53,8%)/6(46,2%) 34(42,5%)/46(57,5%) 0,4
Д. ф. 3 (23,1%) 28 (35%) 0,7
А-Д. ф. 0 1 (0,1%) 0,7
А-Р-Д. ф. 6 (61,5%) 41 (51,3%) 0,9
А-Р. ф. 1 (7,7%) 5 (6,3%) 0,7
Р-Д. ф. 1 (7,7%) 5 (6,3%) 0,7
Длительность 12,2±5,9 (2–19) 14,8±7,9 (3–36) 0,4
течения заболевания
Средний возраст больных БП 71,0±9,3 65,5± 8,8 0,1
(лет)
Средний возраст начала БП (лет) 58,8± 12,4 50,7± 8,7 0,1
Примечание: Д. ф. – дрожательная форма, А-Д. ф. – акинетико-дрожательная форма, А-Р-Д. ф. – акинетико-ригидно-дрожательная
форма, А-Р. ф. – акинетико-ригидная форма, Р-Д. ф. – ригидно-дрожательная форма.
отобраны 35 пациента с БП, не имеющие мутаций в гене LRRK2 и принимающие препараты Л-ДОФА более 5 лет
с положительным эффектом. Была выявлена повышенная частота побочных эффектов при приеме препаратов Л-
ДОФА в группе с наследственной формой БП, обусловленной мутацией G2019S (OR 6,4, pБолезнь Паркинсона и расстройства движений
конце четвертого часа. Гиперкинез нижних конечностей носил императивный характер и представлял собой отры-
вистые размашистые движения обеими ногами и правой руки с захватом (в стадии генерализации) мимической и
жевательной мускулатуры лица и мышц плечевого пояса. Длительность гиперкинеза варьировала от 5 до 30 мин,
гиперкинез «выключения», как правило, был короче и имел дистонический компонент. Коррекция медикаментоз-
ной терапии (в частности добавка минимальных доз церукала) позволила ослабить и даже полностью исключить
эти проявления (гиперкинез «выключения»), но полностью ликвидировать их не удалось. У другой пациентки, с
отсутствием семейного анамнеза, с той же мутацией, на высоте действия препарата развивался гиперкинез головы,
напоминающий хореический и постоянным фоном стала дистония мышц дистальных отделов нижних конечностей.
Совершенно другими были проявления побочных эффектов Л-ДОФА у пациента III-1 из семьи PD1. Терапия
препаратами Л-ДОФА началась у него на втором году заболевания (дебют болезни – в 35 лет) и проводилась прак-
тически непрерывно. Несмотря на достаточно большие дозы (более 1 г в сутки), побочные эффекты проявились
только к 55 годам, не имели моторных компонентов и выражались в усилении психо-эмоциональной нестабиль-
ности, психотических реакциях, напоминающими инволюционные проявления, в итоге ставшими предметом вни-
мания психиатрической службы. У пациента II-2 из семьи PD6 Л-ДОФА также не вызывала двигательных
нарушений, но приводила к периодическим сумеречным зрительным галлюцинациям.
Итак, в настоящем исследовании мы сопоставили клиническое течение заболевания у 13 пациентов с LRRK2-
ассоциированной БП и 80 пациентов с БП без мутации в гене LRRK2 в популяции Северо-Западного региона Рос-
сии. Сопоставление в обеих группах возраста начала заболевания и набора моторных нарушений не выявило
существенных различий. Это, в согласии с мнением других авторов [2, 5, 7, 10], позволяет нам сделать вывод о
сходности симптомов и характера течения LRRK2-ассоциированной формы и БП иной этиологии. Но очевидно
и другое – широкий фенотипический полиморфизм внутри группы с БП, связанной с мутацией в гене LRRK2.
Более того, в одной семье, у носителей одной и той же мутации, но в разных поколениях (родители, дети), могут
быть различными возраст начала заболевания, динамика течения и манифестность отдельных симптомов. В нашем
исследовании в семье PD1 у пациента II-1 носителя мутации G2019S наблюдалось течение болезни с началом за-
болевания в 67 лет с нарушением походки и содружественных движений, сгорбленности и легкой ригидности ске-
летной мускулатуры. Требовалась минимальная терапия, основанная на холинолитиках и препаратов из группы
мидантана. Клиническая картина, дебют заболевания и характер развития у его сына (III-1) были другими. Де-
бютным признаком был мелкий тремор кистей рук, расцениваемый (учитывая возраст – 35 лет) как психогенный.
Добавка гипомимии и перерождение тремора рук в типичный низкоамплитудный тремор покоя с симптомом «зуб-
чатого колеса» и постепенной добавкой ригидности скелетной мускулатуры – сделали клиническую картину более
рельефной. Подобное разнообразие в клинической картине LRRK2-ассоциированной БП отмечалось и ранее [12,
14], но остаётся актуальным вопрос – с чем связана такая вариабельность?
Высказывается мнение о том, что различия в клинической картине G2019S-ассоциированной БП связаны с
особенностями течения заболевания в различных этнических группах. В нашей работе все выявленные носители
мутации G2019S сообщали о происхождении, связанны с евреями-ашкенази, что не удивительно, принимая во
внимание высокую частоту этой мутации среди данной популяции [10]. Носители мутаций R1441C и V1613A имели
славянское происхождение, но вряд ли этот факт помогает в анализе вариабельности проявлений заболевания.
Разнообразие в клинической картине LRRK2-ассоциированной БП не объясняется и локализацией наследуе-
мой мутации, хотя было отмечено более раннее проявление БП у носителей мутаций, локализованных в киназном
домене LRRK2, по сравнению с мутациями, расположенными в других районах белка [6]. В настоящем исследо-
вании также отмечена тенденция к снижению возраста начала заболевания при наличии мутацией G2019S (ки-
назный домен), чем при наличии мутации R1441C и V1613A. Большинство исследований, посвященных возрасту
начала заболевания LRRK2-ассоциированной БП касаются мутации G2019S. Оценки пенетрантности мутации
G2019S сильно варьируются в различных исследованиях. Показано, однако, что пенетрантность данной мутации
не зависит от пола и расовой принадлежности и составляет по оценкам различных авторов в возрасте до 59 лет –
13-45%, в возрасте до 69 лет – 21-85% и в возрасте 79 лет – 74-100% [5, 8]. При этом описан случай бессимптомного
носительства мутации в возрасте 80 лет [9].
Разнообразие фенотипического проявления БП у носителей мутаций в гене LRRK2 позволяют предположить
модифицирующее влияние средовых или генетических факторов на возраст начала и тяжесть течения данной
формы заболевания. Было бы неверным сбрасывать со счетов и влияние дополнительных, не только провоцирую-
щих, но и модифицирующих факторов – экологических. Возможно и влияние разнообразной соматической па-
тологии. С целью выяснения значимости этих факторов для вариативности симптомов заболевания, возраста её
возникновения и тяжести течения LRRK2-ассоциированной БП необходимы дальнейшие исследования.
Значимым итогом нашего исследования является демонстрация более частой встречаемости осложнений при
приеме препаратов Л-ДОФА у пациентов с G2019S-БП (57,1% против 17,1% в группе сравнения). Аналогично вы-
сокая частота (58%) возникновения побочных эффектов у пациентов с мутациями в гене LRRK2 сообщается в ра-
боте Healy с соавт [8]. В данном исследовании, однако, частота осложнений при терапии L-ДОФА превышала 50%
и в группе сравнения. В нашем исследовании курация пациентов с БП в обеих группах осуществлялась по единой
парадигме, где основным является назначение комплексной терапии с набором препаратов из различных фарма-
кологических групп, сообразно форме заболевания. Опыт показывает, что возникновению побочных явлений при
Л-ДОФА терапии зависит не только от дозы препарата, но и от режима их приема и, не в последнюю очередь – от
24 Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫСекция 1. Болезнь Паркинсона
того, на какой стадии заболевания они были введены. Мы старались как можно дольше лечить пациентов мини-
мальной эффективной дозой Л-ДОФА с ее последующим постепенным увеличением. Следует напомнить, что в
данном исследовании большинство больных являлись амбулаторными пациентами и больные с 4-й и 5-й стадией
БП (по классификации M.Hoehn и M.Yahr) практически не фигурируют в нашем анализе. Это позволяет утвер-
ждать, что появление побочных эффектов L-ДОФА хоть и связано с действием препарата, вероятно, базируется
на эндогенных особенностях патогенеза LRRK2-ассоциированной БП. Ещё раз подчеркнём, что частота побочных
эффектов в группе сравнения составила 17,1%, что достоверно ниже, чем в группе пациентов с LRRK2-ассоции-
рованной БП, принимающих препараты L-ДОФА. Повышенная частота L-ДОФА-индуцированных дискинезий
при LRRK2-ассоциированной БП была выявлена также в работах зарубежных авторов [10, 11].
Учитывая широкое распространение мутации G2019S среди семейных форм БП в России, следует рекомендо-
вать скрининг этой мутации среди пациентов с БП, сообщающих о положительном семейном анамнезе заболева-
ния. Генетическое тестирование на наличие мутации G2019S LRRK2 может быть в первую очередь полезно в ряде
случаев в качестве дополнительного диагностического теста. Следует отметить, что пока не будут отработаны чёт-
кие принципы комплексной (прежде всего – медикаментозной) нейропротекторной терапии, досимптоматическое
тестирование мутации останется избыточным и лишенным цели. При проведении медико-генетического консуль-
тирования досимптоматических носителей мутаций в гене LRRK2 следует принимать во внимание неполную пе-
нетрантность мутаций. С другой стороны, относительная распространенность LRRK2-ассоциированных форм
БП среди семейных случаев заболевания впервые дает возможность исследования репрезентативных групп паци-
ентов с однородной этиологией заболевания, что, несомненно, подчеркивает научную важность проведения ДНК-
диагностики пациентам с семейной формой БП. Выделение групп риска развития БП дает неврологам шанс
Рисунок 1. Родословные семей с LRRK2-ассоциированной БП.
А. G2019S-ассоциированная БП (n-норма; m-мутация G2019S в гетерозиготном состоянии, указан возраст на момент обследования, в скобках
– возраст начала заболевания).
Б. V1613A-ассоциированная БП (m-мутация V1613A в гетерозиготном состоянии, указан возраст на момент обследования, в скобках –
возраст начала заболевания).
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ 25Болезнь Паркинсона и расстройства движений
подбора терапии, способной отодвинуть клиническое проявления болезни. При скрининге мутаций в гене LRRK2
в первую очередь целесообразно проводить идентификацию мутации G2019S, частота которой среди семейных
форм БП в России достигает 7%.
Полученные нами данные говорят о сходности клинического течения LRRK2-ассоциированной БП и БП, не
связанной с мутациями в этом гене, а также позволяют предполагать повышенную частоту осложнений при терапии
Л-ДОФА у пациентов с мутацией G2019S. Дальнейшее развитие исследований в сфере молекулярной генетики на-
следственных форм БП в сочетании с тщательным неврологическим анализом позволит не только улучшить курацию
данной группы пациентов, но существенно продвинуться во всё ещё нерешенных вопросах этиопатогенеза БП.
Литература
1. Голубев В.Л., Левин Я.И., Вейн А.М. Болезнь Паркинсона и синдром паркинсонизма. М.: МЕДпресс-информ, 2000.
2. Иллариошкин С.Н., Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование в неврологии. М.: МИА, 2002.
3. Пчелина С.Н., Иванова О.Н., Емельянов А.К. и др. Мутации в гене LRRK2 у больных с болезнью Паркинсона в России. Мед. генетика 2006; 5: 48-51.
4. Скоромец А.А., Скоромец А.П., Скоромец Т.А. Нервные болезни. М.: МЕДпресс-информ, 2005.
5. Elbaz A. LRRK2: bridging the gap between sporadic and hereditary Parkinson's disease. Lancet Neurol. 2008; 7: 562-564.
6. Golub Y., Berg D., Calne D.B. et al. Genetic factors influencing age at onset in LRRK2-linked Parkinsons disease. Parkinsonism Relat. Disord. 2009; 15: 539-541.
7. Haugarvoll K., Rademakers R., Kachergus J.M., et al. LRRK2 R1441C parkinsonism is clinically similar to sporadic Parkinson disease. Neurology 2008; 70: 1456-1460.
8. Healy D.G., Falchi M., O'Sullivan S.S. et al. Phenotype, genotype, and worldwide genetic penetrance of LRRK2-associated Parkinson's disease: a case-control study. Lancet Neurol. 2008; 7:
583-590.
9. Kay D.M., Kramer P., Higgins D. et al. Escaping Parkinson's disease: a neurologically healthy octogenarian with the LRRK2 G2019S mutation. Mov. Disord. 2005; 20: 1077-1078.
10. Lasage S., Brice A. Parkinson’s disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors. Hum. Mol. Genet. 2009; 18: R48-R59.
11. Nishioka K., Kefi M., Jasinska-Myga B. et al. A comparative study of LRRK2, PINK1 and genetically undefined familial Parkinson's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 2010; 81: 391-
395.
12. Paisan-Ruiz C., Jain S., Evans E.W. et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 2004; 44: 595-600.
13. Payami H., Larsen K., Bernard S., Nutt J. Increased risk of Parkinson's disease in parents and siblings of patients. Ann. Neurol. 1994; 36: 659-661.
14. Pchelina S.N., Yakimovskii A.F., Ivanova O.N. et al. G2019S LRRK2 mutation in familial and sporadic Parkinson’s disease in Russia. Mov. Disord. 2006; 21: 2234-2236.
15. Pchelina S.N., Yakimovskii A.F., Emelyanov A.K., et al. Screening for LRRK2 mutations in patients with Parkinson's disease in Russia: identification of a novel LRRK2 variant. Eur. J. Neurol.
2008; 15: 692-696.
26 Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫСекция 1. Болезнь Паркинсона
Молекулярно-генетический анализ и факторы
риска болезни Паркинсона у лиц
узбекской национальности
Х.М. Халимова 1, Р.С. Мухамедов 2, М.М. Раимова 1, Р.Ж. Матмуродов 1,
Е.В. Жмырко 2, Ш.С. Пулатова 3
1
Ташкентская медицинская академия; 2 Институт Биохимии АН РУз;
3
Республиканская клиническая больница №1 Минздрава Республики Узбекистан (Ташкент)
В настоящее время актуальность изучения различных аспектов болезни Паркинсона (БП) не вызывает сомне-
ния. Распространенность данной патологии увеличивается с каждым годом, и данная тенденция будет сохраняться
в связи с увеличением продолжительности жизни населения, особенно в развитых странах [2, 9]. В Республике Уз-
бекистан в течение последних 10-15 лет также наблюдается учащение случаев регистрации новых случаев БП, как
среди городского, так и особенно среди сельского населения. Данную тенденцию можно частично объяснить улуч-
шением качества диагностики заболевания. Однако имеются и другие причины повышения частоты случаев БП,
которые нуждаются в тщательном изучении.
Сегодня является общепризнанным значимый вклад генетических факторов в развитие БП [1-4, 11, 13]. Риск
развития болезни, как было показано в больших популяционных исследованиях, среди ближайших родственников
пациентов с болезнью Паркинсона достигает 4-10%, что существенно превышает общепопуляционный риск. Ана-
лиз многочисленных независимых результатов исследований БП позволяет сделать вывод, что БП является муль-
тифакториальной патологией, в развитии которого определенную роль играют различные гены. При
аутосомно-доминантных формах БП были идентифицированы мутации в генах альфа-синуклеина (SNCA),
LRRK2, и убиквитин-С-концевой гидролазы L1 (UCH-L1) [4-6, 8, 15, 16, 18, 20]. При аутосомно-рецессивных
формах идентифицированы мутации в генах паркин (PARK2), PINK1 и белка DJ-1 [1, 3, 6-8, 17]. Кроме того, опре-
делен целый ряд генов предрасположенности к БП (гены систем клеточной детоксикации и антиоксидантной за-
щиты, гены транспорта и метаболизма дофамина, митохондриальный геном и другие), носительство
неблагоприятных аллельных вариантов которых достоверно повышает риск заболевания [6, 7, 10, 14, 20, 22]. Для
понимания наследственных основ БП, как и других мультифакториальных заболеваний, необходимо установить,
какие именно «неблагоприятные» полиморфизмы генов и их сочетания приводят к высокой вероятности развития
патологии. Учитывая немаловажную роль системы детоксикации в обезвреживании вредных веществ, поступаю-
щих в организм человека в процессе бытовой и производственной деятельности, поиск генетических маркеров
индивидуальной чувствительности больных, подвергающихся воздействию вредных веществ, на основе анализа
полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при паркинсонизме, представляется актуаль-
ным [5, 7, 10, 14, 21, 23-25]. В ряду факторов, способствующих развитию БП, большое значение придается под-
верженности населения неблагоприятным эколого-средовым воздействиям. Наиболее вероятными кандидатами
на роль токсинов при БП являются некоторые пестициды, которые в условиях in vitro способны вызывать кон-
формационные изменения молекулы α-синуклеина и ускорять формирование патологических включений в ней-
ронах [5, 7]. Предполагается, что агрессивное агрохимическое производство и соответствующая экологическая
обстановка могут явиться серьезным фактором, способствующим общему росту заболеваемости БП, а также при
особенно неблагоприятном развитии событий – накоплению более ранних случаев болезни в определенных суб-
популяциях [5].
В этой связи авторами данного сообщения были разработаны проекты исследований молекулярно-генетиче-
ских, клинико-анамнестических и санитарно-гигиенических аспектов БП среди коренного населения Республики
Узбекистан. Данные проекты были поддержаны государственными грантами ФЕСС-005, ИДСС-31.16 согласно
программе «Охрана здоровья населения на основе совершенствования имеющихся и создания новых методов и
технологий в медицине». Эти исследования в нашей республике проводятся с 2007 года по настоящее время. В
данном сообщении приводятся первичные результаты исследований.
Цель исследования: анализ молекулярно-генетических, санитарно-гигиенических аспектов БП среди коренного
населения Республики Узбекистан.
Пациенты и методы исследования
Под нашим наблюдением находились 210 пациентов с БП. Нозологическая диагностика паркинсонизма про-
водилась с использованием клинических диагностических критериев банка мозга Общества болезни Паркинсона
Великобритании (Hughes et al., 1992). Оценку тяжести неврологического дефицита проводили при помощи уни-
Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫ 27Болезнь Паркинсона и расстройства движений
фицированной рейтинговой шкалы проявлений паркинсонизма (UPDRS), стадию заболевания определяли по
шкале Хен и Яра в модификации Lindval и соавт. (1989).
Молекулярно-генетические исследования проведены на образцах ДНК 180 больных БП, из них 88 женщин и 92
мужчины, в возрасте от 29 до 82 лет, средний возраст 54,8±11,8 лет. В качестве контрольной группы обследованы 80
неврологически здоровых лиц сопоставимого возраста и пола. При отборе конкретных лиц учитывали их нацио-
нальную принадлежность: были выбраны неродственные лица узбекской национальности. Молекулярно-генети-
ческие исследования проведены в Центре геномных технологий (ЦГТ) при Институте Генетики и
Экспериментальной Биологии Растений (ИГиЭБР) и в Институте Биохимии Академии Наук Республики Узбеки-
стан (АН РУз). К настоящему времени нами проведен анализ на наличие ассоциаций с БП: мутации Ala53Thr в гене
PARK1, мутаций T240M и T240R гена PARK2, мажорной мутации G2019S в гене LRRK2; полиморфизмов генов
GSTM1 (нулевой аллель), GSTT1 (нулевой аллель) методом полимеразной цепной реакции с использование спе-
цифических олигонуклеотидных маркеров для отдельных участков геномной ДНК человека. Материалом для ДНК
служила венозная кровь из локтевой вены объемом 1 мл. Выделение ДНК из цельной крови осуществлялось набо-
ром реагентов Diatom™ DNA Prep 200 (ООО «Лаборатория ИзоГен», Москва) по стандартному протоколу. Супер-
натант с ДНК далее подвергался непосредственно генотипированию путем предварительного лигирования, а затем
ПЦР-амплификации. Типирование образцов ДНК по генам PARK1, PARK2 и LRRK2 производили с использова-
нием специфических олигонуклеотидных праймеров к участкам соответствующих генов. ПЦР-анализ проводили
с использованием набора реагентов для ПЦР амплификации ДНК GenePak™ PCR Core («Лаборатория ИзоГен»).
Далее проведен ПДРФ анализ с использованием рестриктаз:
1. Tsp45I («NEB», Англия) – для определения Ala53Thr мутации в гене PARK1;
2. HpyCH4IV («NEB», Англия) – для детекции T240M/T240R мутации в гене PARK2;
3. BstSFI («СибЭнзим», Россия) – для определения мутации G2019S в гене LRRK2.
Рестрицированные ПЦР-продукты амплификации фракционировали в 2–3% агарозном геле или 6% поли-
акриламидом геле в течение 60–90 мин при напряжении 100-120 В, окрашивали бромистым этидием и визуали-
зировали в УФ-свете.
Типирование образцов ДНК по генам GSTM1 и GSTT1 проводили с использованием двух пар специфических
олигонуклеотидных праймеров с участками генов GSTM1 (F: 5’-tgs-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc; R: 3’-gtt-ggg-ctc-aaa-
tat-acg-gtg-g) и GSTT1 (F: 5’-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg; R: 3’-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg).
Гомозиготность по нулевым аллелям (0/0) GSTM1 и GSTT1 определяли по отсутствию на электрофореграммах
фрагментов размером 131 и 114 п.н., соответственно. Наличие этих фрагментов свидетельствовало о присутствии,
по крайней мере, одной нормальной (без делеции) копии генов (гомо- и гетерозиготы, +/+ и +/0). Нулевые аллели
генов GSTM1 и GSTT1 свидетельствовали в свою очередь о предрасположенности объекта к БП. Для определения
размера фрагментов ДНК использовался маркер с начальной отметкой 100 п.н.
Санитарно-гигиенические исследования проведены с помощью специально разработанной и утвержденной
анкеты-опроса (интервьюирования), состоящего из 64 пунктов, наиболее полно охватывающих все основные фак-
торы как биологического, так и санитарно-гигиенического характера, а также клинико-анамнестические данные,
которые позволяют определить их роль в развитии БП.
Результаты и обсуждение
Клиническая характеристика обследованных больных показала преобладание пациентов со смешанной формой
заболевания – 45%; по тяжести заболевания превалировали больные во II стадии; возраст дебюта заболевания и
возраст пациентов на момент заболевания чаще соответствовал среднему (45-59 лет, по классификации ВОЗ) и их
удельный вес составил 40% и 43,3% соответственно. Средняя продолжительность заболевания составила 6,4±3,8
лет; темпы прогрессирования БП чаще соответствовали умеренным (55,5%). Средние баллы по шкале UPDRS (II
и III подшкалы – дневная активность и двигательная активность) составили в среднем 21,3±2,2 и 43,5±4,3 баллов
соответственно (таблица 1).
Анализ мутации в гене PARK1 (Ala53Thr)
Мутация Ala53Thr в гене PARK1 в исследуемой выборке больных не была выявлена ни у одного из 180 обсле-
дованных больных. По-видимому, данная мутация не ассоциирована с развитием БП у пациентов узбекской на-
циональности. Эти результаты согласуются с данными других авторов и свидетельствуют о том, что для
Узбекистана, как и для большинства других популяций мира, первичные синуклеинопатии не типичны.
Скрининг мутации T240M/T240R гена PARK2
Нами был проведен ПДРФ-анализ мутации T240M/T240R в гене PARK2 у всех 180 пациентов БП и в контроль-
ной группе. По результатам этих анализов гена PARK2 в исследуемой выборке наблюдается отсутствие данной му-
тации у всех пациентов как в группе с БП, так и в контрольной группе.
28 Часть I АННОТИРОВАННЫЕ ДОКЛАДЫВы также можете почитать
