FISH анализ как метод определения хромосомных аберраций возможности и й области применения р - Пилип Л.Я.
←
→
Транскрипция содержимого страницы
Если ваш браузер не отображает страницу правильно, пожалуйста, читайте содержимое страницы ниже
FISH анализ как метод
FISH‐анализ
определения хромосомных
аберраций
б й ((возможности и
области применения)
р )
Пилип Л.Я.
(зав. лабораторией цитогенетики, Клиника
Репродуктивной Медицины «Надия»)
• FISH (fluorescence in situ hybridization) молекулярно‐цитогенетический метод; был разработан в 1980‐х для определения наличия или отсутствия последовательностей ДНК на хромосоме
Преимущества FISH Эффективность, быстрота и относительная простота метода FISH делают его полезным инструментом для диагностики хромосомных аномалий й как в постнатальном, так и в пренатальном периоде, включая предимплантационный
Типы проб для FISH
• Центромерные ‐ CEP
• Теломерные ‐ Tel Centromeric (satellite)
• Пробы на всю хромосому‐
хромосому WCP probes
• Локус‐специфические ‐ LSI
Locus specific
p
probes
Whole chromosome
painting probes
Области применения FISH
Предимплантационная Постнатальная
Пренатальная диагностика
генетическая диагностика диагностика
• Предимплантационный • Скрининг основных • Уточнение/верификация
генетический скрининг анеуплоидий результатов стандартного
(определение некультивированных цитогенетического
анеуплоидий й хромосом клеток амниотическойй исследования
13,15,16,17,18,21,22,X,Y) жидкости • Скрининг анеуплоидий
• Предимплантационная • Уточнение/верификация сперматозоидов
генетическая диагностика результатов стандартного • Исследование сегрегации
(
(исследование цитогенетического хромосом у носителейй
дериватных хромосом у исследования структурных перестроек
носителей хромосомных • Исследование природы
перестроек) маркерных хромосом
• Исключение сложных
перестроек ‐ тройных и
более сложных
транслокаций, инсерций
• Исследование
хромосомных перестроек
в онкогематологии
•ДДиагностика солидных
д
опухолей
Пример использования FISH в
онкологии
• Характеристика чувствительности рака молочной железы к
химиопрепаратам (герцептин)
Хромосома
17
Ген
Her2
Нормальная клетка Клетка с полисомией
177
Амплификация
диагностируется при
соотношении количества
копий гена Her2 к
количеству
центромер(хромосом) 17
Клетка с амплификацией Her2
>2,2 © Клименко C.В., Захарцева Л. М., 2011
Паттерны гибридизации с пробами Her2/CEP17
A B C
D E F
© Клименко C.В., Захарцева Л. М., 2011
Хромосомные перестройки у супружеских пар с бесплодием
Транслокации – наиболее частые структурные хромосомные перестройки,
определяемые у супружеских пар с бесплодием, поскольку фенотипически не
проявляются у носителей
Типы транслокаций
р
Робертсоновские транслокации Реципрокные транслокации
46,XY,der(13;14)(q10;q10) 46,XY,Yqh‐,t(2;17)(q31;p13)
Частота 0,12
0 12 %
%* Частота 0,14%
0 14%*
*Nielsen, J. and Wohlert, M. (1991) Chromosomes abnormalities found among 34 910 newborn children: results from
13‐year incidence study in Aarhus, Denmark. Hum. Genet., 87, 81–83.
Схема распределения хромосом в гаметах носителей транслокаций
В мейозе I дериватные
хромосомы и их
нормальные гомологи
могут сегрегировать с
образованием
б
несбалансированных
гамет
Последствия:
•Бесплодие
•Невынашивание
•Мертворождение или
ранняя детская смертность
Рождение детей с
•Рождение
хромосомными
аномалиями
Huret JL, Leonard C, Savage JRK . Chromosomes, Chromosome Anomalies. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. May, 2000
Подтверждение/уточнение результата кариотипирования
• Пациент 1970 г.р.
•
•
Олигоастенотератозооспермия
У супружеской
у ру парыр одно
д спонтанное
Кариотип –
прерывание беременности в 12 нед. 45,ХУ,der(5;15)t(?q35.3;?q10)
C‐banding
GTG‐bandingПодтверждение/уточнение результата кариотипирования с
использованием метода FISH
Tel5p
Tel5q
T l5 SO
Tel5p
Tel5p SO
CEP15 (satellite III) SO
CEP15 (α‐satellite) SA
5 Tel5qSG
Tel5qSG 15
15 der(5;15) 5
der(5;15) CEP15
Результат стандартного
цитогенетического
исследования ‐
45,ХУ,der(5;15)t(?q35.3;?q10)
45,ХУ,der(5;15)t(q35.3; q10)Подтверждение/уточнение результата кариотипирования с
использованием WCP‐проб
р (OctoChrome,Cytocell)
( , y )
8
8 2
15 12 2
1
3 20 20
17 21 13
16
19 16 13
17
3 21 12
15 1
19
10 7 10
22 4
5
14
11 18 6 X
11
14
9 6
18
9 22 4 5 X
7Подтверждение/уточнение результата кариотипирования с
использованием WCP‐проб (OctoChrome,Cytocell)
7 10 10
10
5
5
7
q24
13
2 2
20 20
13
13
q14
46,XX,?t(10;13) 46,XX,t(10;13)(q24;14)Подтверждение/уточнение результата кариотипирования с
использованием WCP‐проб (OctoChrome,Cytocell)
X
q13.3
19
q27
46,XX,der(19)?t(19;?) 46,Х,t(X;19)(q27;q13.3)Подтверждение/уточнение результата
кариотипирования
р р с использованием WCP‐проб
р
(OctoChrome,Cytocell)
Кариотип пациента:
46,XY,?t(6;10)9
11
9 22
22
d (6)
der(6
11
5
7
7
der(11) 10
10 5
der(6)
der(10)
X
Y 6Установление происхождения маркерных хромосом
Маркерная хромосома представляет собой изохромосому по
коротким плечам с центромерным участком 21 хромосомы.Многоцветная FISH в постанатльной и пренатальной
диагностике позволяет (с учетом результатов
стандартного цитогенетического исследования)
• подтвердить наличие хромосомной й перестройки;
й
исключить наличие более сложной перестройки у
носителей р
реципрокных
ц р транслокаций;
р ц ;
• выявить или подтвердить хромосомы, вовлеченные в
перестройку;
• уточнить точки разрыва хромосом;
• определить
р д происхождение
р д маркерных
р р хромосом;
рИспользование метода FISH для исследования уровня
анеуплоидий сперматозоидов
18
Х
18
Y
Y‐ несущий Х – несущий
сперматозоид сперматозоид
Анеуплоидные сперматозоиды
18
X Y
Х Y
Y
Х 18
18
18
Дисомия хромосом 18,Х 18,Х,Y 18,Y,YС
Скрининг анеуплоидий
й хромосом сперматозоидов (n=350)
( 350)
Результаты спермограммы К‐во пациентов с повышенным
уровнем анеуплоидий
сперматозоидов,%
нормозооспермия 6,5%
астенозооспермия 23,8%
олигоастенотератозооспермия 78,3%
Пациентам с повышенным уровнем анеуплоидий
рекомендовано проведение ИМСИ
(интрацитоплазматическая инъекция
морфологически отобранных сперматозоидов)x200 ICSI x6300 IMSI
Исследование сегрегаций хромосом у носителей
структурных перестроек методом FISH
Уровень хромосомных аномалий у носителей транслокаций варьирует от 18 до 82%,
в зависимости от типа перестройки и хромосом, вовлеченных в перестройку
Кариотип пациента
46,XY,Yqh‐,t(2;17)(q31;p13)
2 17 der(2) der(17)
27,3% сбалансированных сперматозоидов ‐ прогноз для проведения цикла ICSI/IMSI/PGD
Сигнал % сперм а Хромосомный дисбаланс (ожидаемый)
тозоидов
д
AOOG 2,17 или der(2), 27,3 Сбалансированный набор
der(17)
AOG 17, der(2) 23,9 Делеция 2q31‐2qter, дупликация 17р13‐17pter
AOOOG 2 der(17)
2, 16,2 Дупликация 2q31‐2qter,
2q31 2qter, делеция 17р13
17р13‐17pter
17pter
AO der(17) 5,9 Делеция 2pter‐2321, делеция 17р13‐17pter
GOO 2 6,8 Моносомия 17
GO der(2) 1,7 Делеция 17p13‐17qter, делеция 2q31‐2qter
A 17 0,9 Моносомия 2
Другие Другие 17,3 Другие несбалансированные наборы
комбинации комбинацииИсследование сегрегаций хромосом у носителей
количественных аномалий методом FISH
Кариотип 47,XYY
Олигоастенотератозооспермия
Х Y XY YY XX XXY XYY
47,XYY 43.7 44.8 0.88 4.7 0.3 0.1 ‐
11.5% аномалий половых хромосом + ~3% диплоидных сперматозоидовРезультаты ПГД; кариотип супруга 47,XYY
Прогноз: 14% анеуплоидных сперматозоидов
Цикл IMSI/PGD
ET 2
2‐хх эмбрионов
Наступила беременность ‐ двойня
Эмбрион пол 13 18 21 комментарии
1 ХХ 2 2 2 Normal ET
2 ХХ 2 2 2 Normal ET
3 ХХ 2 1 1 18,21 monosomy
4 XY 2 2 2 Normal Cryo
5 XX 2 2 3 21 trisomy
ti
6 XX 2 2 2 Normal Cryo
7 XXX 3 3 3 triploid
pИспользование метода FISH в предимплантационной
генетической диагностике
• На сегодня ПГД – единственный возможный способ
выявления хромосомных нарушений у эмбрионов.
эмбрионов
• 56% морфологически нормальных эмбрионов женщин
после 35 имеют хромосомные аномалии.Показания для проведения Показания для проведения
предимплантационной предимплантационного
генетической диагностики генетического скрининга (PGS)
(PGD)
• Возраст женщины, проходящей IVF,
• Наличие
более 37 лет
подтвержденных
• Бесплодие неустановленнойй
структурных
этиологии
хромосомных
• Многократные неудачные попытки
перестроек
IVF
• Привычное невынашивание
беременности
р невыясненной
этиологии
• Высокая частота анеуплоидий
сперматозоидов (тяжелые формы
мужского бесплодия)
• Наличия в анамнезе беременности
или рождения ребенка с
хромосомной патологией¾ циклов ПГД – скрининг анеуплоидий Вопросы: 1. Что биоптировать? 2 Как фиксировать? 2. 3. Сколько хромосом анализировать? 4. Как учитывать результаты? 5. Какие зонды использовать?
Что биоптировать и сколько?
• Биопсия 1 и 2 полярного тельца
• Биопсия бластомера (6‐8 клеток,
3‐ее сутки)
3
• Трофэктодермальная биопсия
бластоцисты (5
(5‐6
6 сутки)Биопсия бластомера
Е
Если биопсия
б б
бластомера ‐ биопсия
б ОДНОГО б
бластомера !!!Сколько хромосом анализировать?
Наиболее частые анеуплоидии
на стадии 8 клеток
22, 16, 21, 15
«Синдромальные»
анеуплоидии
13, 18, 21, XY
Минимальный стандарт 8
хромосом:
13,15,16,18,21,22,XY
ESHRE PGD consortium best practice guidelines for fluorescence in situ
hybridization –based PGD //Human Reproduction. ‐ 2010Варианты преимплантационного генетического
скрининга методом FISH
5 хромосом (13,18,21,XY)
(13 18 21 XY) 9 хромосом
• 28‐31% анеуплоидий (13,15,16,17,18,21,22,XY)
• 70
70‐72%
72% анеуплоидий
12 хромосом
(8,13,14,15,16,17,18,20,21,22,XY)
• 79‐80% анеуплоидий
Munne s. et al. Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction
outcomes // Fertility Sterility 2010. – Vol. 94Как учитывать результаты FISH исследования на
одной клетке?
• Критерии:
1. Размер сигнала
Обязательно 2 исследователя
2. Интенсивность сигнала
3. Расстояние между сигналами
X 21
21
18
13
13
YИспользование NRR (no result rescue)
NRR – дополнительный раунд гибридизации с использованием
пробы для той же хромосомы, но другого типа, желательно, другого
цвета
NRR позволяет снизить частоту сомнительных результатов с 7,5%
7 5% до
3,1%Технические ограничения метода FISH при
проведении ПГС
– Ограниченное количество флуорохромов
анализ ограниченного количества хромосом ( до 9‐12,
“gold standard”) (13,15,16,17,18,21,22,X,Y)
– Наслоение сигналов,, р
расщепление
щ сигналов,, низкая
эффективность гибридизации, нарушения процесса
фиксации бластомеров до 6‐10% эмбрионов
без диагностики
– Отсутствие возможности определить мозаицизм при
работе с одной клеткой
34Исспользования метода многоцветной FISH
в пренатальной диагностике
1. уточнение/подтверждение результатов
д р
стандартного ц
цитогенетического
исследования;
2. «скрининговый» экспресс‐анализ
анеуплоидий хромосом 13,18,21,XY на
интерфазных ядрах некультивированных
клеток амниотической жидкости;Использование метода FISH для экспресс‐скрининга
анеуплоидий в пренатальной диагностике
21 Сроки стандартного кариотипирования – 21 день*
день
На практике – 10‐14 дней
21
13
13
21
AneuVysion ,Vysis
Vysis X
LSI 21 SO, LSI 13 SG
Y 18
18
Скрининг анеуплоидий хромосом
AneuVysion ,Vysis
13,18,21,X,Y CEP 18 SA,, CEP X SG,, CEP Y SO
(80% хромосомной патологии,
определяемой пренатально)
методом FISH – 24‐48 часов.
*МОЗ України. Стандарти аналізу препаратів хромосом
людини (методичні рекомендації). – Київ 2003Пренатальная диагностика
микроделеционных синдромов методом FISH
Комплекс сндромов CATCH 22
К
(DiGeorge/Velo‐Cardio‐
Facial/ShprintzenSyndrome)
микроделеция
Ограничение метода: диагностика проводится на конкретную патологию, и не
позволяет исключить аномалию в неисследуемых
у уучастках. Д
Для качественной
дифференциальной диагностики требуется значительная библиотека зондовИспользование метода FISH для исследования
анеуплоидий клеток ворсин хориона неразвивающихся
беременностей
Стандартное кариотипирование
Низкая митотическая
Патология активность культуры клеток/ Патологии не
кариотипа обнаружено ~35%
отсутствие жизнеспособных
~20%
клеток ‐‐‐‐‐кариотип не
~ 45% получен
Привычное
FISH (8 хромосом)
невынашивание
13,15,16,18,21,22,XY
беременности
~60%
~40%
Обнаружено Анеуплоидии
анеуплоидии хромосом не
13,15,16,18,21,22,XY обнаружено
Исследование
кариотипа
родителей aCGHЗаключение
FISH служит полезным инструментом для
диагностики хромосомных
д р аномалий
как в постнатальном, так и в пренатальном
периоде,
р д включая д доимплантационный
ц
Современный уровень развития метода FISH
позволяет быстро и с высокой точностью
идентифицировать практически любые
аномалии кариотипа• Н
На сегодня FISH –метод, позволяющий
й проводить
скрининг предимплантационных эмбрионов по
наиболее частым анеуплоидиям.
• Предимплантационная генетическая диагностика
методом FISH позволяет проводить исследование
анеуплоидий хромосом, но не дает полного
представления о кариотипе и не позволяет
исключить мозаицизм.Спасибо за внимание
l.pylyp@ivf.com.ua
www.ivf.com.uaВы также можете почитать
