ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ - КРАСНОГО (625 нм) И ИНФРАКРАСНОГО (805 нм) - Известия Саратовского ...
←
→
Транскрипция содержимого страницы
Если ваш браузер не отображает страницу правильно, пожалуйста, читайте содержимое страницы ниже
Е.С. Тучина, В.В. Тучин, Г.Б. Альтшулер, И.В. Ярославский. Фотодинамическое воздей-
ствие
УДК 535+57 (023)
ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ
КРАСНОГО (625 нм) И ИНФРАКРАСНОГО (805 нм)
ИЗЛУЧЕНИЯ НА БАКТЕРИИ P. ACNES,
ОБРАБОТАННЫЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРАМИ
Е.С. Тучина, В.В. Тучин, Г.Б. Альтшулер*, И.В. Ярославский*
Саратовский государственный университет,
кафедра
* Паломар Медикал Технолоджис, Бурлингтон, США
E-mail: firstflower@yandex.ru
Исследованы закономерности индуцированного красным и ин- недостатки, связанные с индивидуальными
фракрасным излучением подавления колониеобразующей спо-
собности бактерий Propionibacterium acnes в присутствии таких
особенностями пациентов, длительностью и
фотосенсибилизаторов, как метиленовый синий и индоцианин способом применения антибиотиков [7].
зеленый. Установлен дозозависимый эффект действия красного Фототерапия может стать удачной аль-
и инфракрасного излучения. Полученные результаты рассматри- тернативой при лечении угревой сыпи. При-
ваются с точки зрения оценки эффективности действия излуче-
ния в сочетании с фотосенсибилизаторами при фотодинамиче- менение подобных методов стало возмож-
ской терапии кожных гнойно-воспалительных заболеваний. ным в результате исследований по взаимо-
действию света и биотканей, а также благо-
Photodynamic Influence of Red (625 nm) and Infra-Red (805 nm) даря развитию лазерной и светодиодной тех-
Radiation on Bacteria P. Acnes Processed by Photosensitizes
ники [8, 9].
E.S. Tuchina, V.V. Tuchin, G.B. Altshuler, I.V. Yaroslavsky В настоящей работе мы исследовали в ус-
ловиях in vitro чувствительность микроорга-
It was shown, that Propionibacterium acnes was rather subjected to
action of red and infrared radiation. The effect of the given radiation
низмов P. acnes к действию красного (625 нм)
amplified at this bacteria by various solutions of photosensitizes. The и инфракрасного (805 нм) излучения в сочета-
received results are considered from the point of view of an estima- нии с применением фотосенсибилизаторов –
tion of light action efficiency in a combination to photosensitizes at метиленового синего и индоцианина зеленого.
photodynamic therapy skin suppurative inflammation diseases.
1. Материалы и методы
Введение
В качестве объекта исследования ис-
В последние десятилетия лазерная и пользовали штамм Propionibacterium acnes
световая терапия активно развивается и на- Ас-1450 (коллекция ИБФМ РАН). Микроор-
ходит широкое применение при лечении ганизмы выращивали при температуре 37°С
кожных заболеваний [1−3]. на агаризованной тиогликолиевой среде с
Acne vulgaris является хроническим за- добавлением 5%-ной гемолизированной кро-
болеванием сальных желез и встречается личьей крови или 0.02% БСА. Посевы инку-
достаточно часто. Наибольший интерес в бировали в анаэростате в безкислородной
данном случае представляют бактерии Pro- среде (газовая смесь N2:CO2 = 9:1).
pionibacterium acnes (P. acnes). Микроорга- Источником красного излучения служил
низмы этого вида входят в состав нормаль- мощный светодиод с максимумом спектра
ной микрофлоры кожи человека и заселяют испускания на длине волны 625 нм и плотно-
сальные железы. Это грамположительные стью мощности 31 мВт/см2. В ходе экспери-
анаэробные или микроаэрофильные палочки ментов в качестве источника лазерного излу-
неправильной формы. Особенностью физио- чения использовали лазер (OPC–BO15–MMM–
логии P. acnes является синтез и накопление FCTS, Opto Power Corp., Tucson, Arizona)
значительного количества порфирина [4−6]. с максимумом спектра испускания на длине
Как правило при лечении угревой сыпи волны 805 нм, световодным выходом и плот-
назначают антибактериальные препараты, а ностью мощности 50 мВт/см2 на поверхности
также ретиноиды. Подобная терапия имеет среды. Время облучения варьировали от 5 до
Е.С. Тучина, В.В. Тучин, Г.Б. Альтшулер,
И.В. Ярославский, 2008Известия Саратовского университета. 2008. Т. 8. Сер. Физика, вып. 1
30 мин, тем самым набирали дозу облучения, ты. После воздействия светом в течение
необходимую для подавления образования 5, 10, 15 и 30 мин культуру переносили на
колоний бактериями. чашки Петри с плотной питательной средой
Для проведения экспериментов исполь- и равномерно распределяли по поверхности
зовали 8- или 96-луночную полистирольную агара стерильным шпателем. Учет результа-
планшету с круглодонными ячейками. Со- тов проводили путем подсчета колониеобра-
держимое одной ячейки соответствовало од- зующих единиц (КОЕ) через 5 дней после
ной экспериментальной точке. При проведе- инкубации при 37 ºС. Принято считать, что
нии опытов по воздействию света источник одна колония на плотной питательной среде
излучения располагали точно над соответст- является потомством одной микробной клет-
вующей ячейкой. Для достижения необходи- ки. Таким образом, при количественном уче-
мой плотности мощности излучения выбира- те оказываемого воздействия правомерно под-
ли расстояние от центра ячейки до источника считывать КОЕ – данный показатель отража-
света: 1.5 см – для красного (625 нм) свето- ет количество выживших под действием не-
диода; 50 см – для инфракрасного (805 нм) благоприятного фактора бактериальных кле-
лазера. После проведения эксперимента со- ток. Контролем служили данные колониеоб-
держимое каждой ячейки переносили с по- разующей способности бактерий: 1) не обра-
мощью микропипетки на поверхность плот- ботанных фотосенсибилизаторами и 2) не под-
ной питательной среды и равномерно рас- вергнутых облучению. Каждая эксперимен-
пределяли стерильным шпателем. тальная точка является усреднением 10 про-
В качестве фотосенсибилизаторов ис- веденных опытов.
пользовали индоцианин зеленый (ИЗ) и ме-
тиленовый синий (МС). Индоцианин зеле- 2. Результаты
ный готовили в концентрации 0.1% на основе Для определения возможной токсично-
дистиллированной воды и смеси глицерина, сти красителей определяли колониеобра-
этанола и воды в соотношении 25:45:30. Ме- зующую способность (КОС) бактерий после
тиленовый синий готовили в концентрации их инкубации с фотосенсибилизаторами без
0.025% на основе дистиллированной воды и облучения. Из рис. 1, а следует, что метиле-
смеси глицерина, этанола и воды в соотно- новый синий не воздействует на КОС микро-
шении 25:25:50. организмов только в концентрации меньше
Способность бактерий к образованию 0.025%. Концентрация индоцианина зеленого
колоний оценивали по числу выросших ко- < 0.1% не оказывает токсического действия
лоний после посева на агаризованную среду на микроорганизмы (рис. 1, б).
анализируемых образцов соответствующих Из литературных данных известно, что
разведений и их выращивания в анаэробных длительность обработки клеток микроорга-
условиях при 37 °С в течение 5 суток. низмов фотосенсибилизаторами может при-
В работе использовали реактивы фирм вести к бактериостатическому или бактери-
«Sigma» (Сент-Луис, США) и индоцианин зе- цидному эффекту или, напротив, быть недос-
леный производства Aldrich Chemical Co., USA. таточной для достижения фотоинактивации
Для проведения экспериментов исполь- [7]. Представляло интерес изучить законо-
зовали трехсуточную культуру исследуемого мерности подавления размножения бактерий
штамма P. acnes. Методом последовательных фотосенсибилизаторами. Для этого клетки
разведений достигали концентрации бакте- преинкубировали с красителями различное
риальной взвеси 1000 микробных клеток на время и учитывали число КОЕ. На рис. 2
миллилитр (мк/мл). Из разведения микроор- представлены данные по изменению показа-
ганизмов 10000 мк/мл 1 мл взвеси вносили теля КОЕ в зависимости от времени преин-
в 9 мл растворов фотосенсибилизаторов (ФС), кубации бактериальных клеток в растворе
инкубировали в течение 10 мин без доступа красителя. Как оказалось, 10−15 мин преин-
света. Из конечного разведения, а также из кубации с фотосенсибилизатором достаточно
растворов ФС, взвесь объемом 0.2 мл вно- для достижения при последующем облуче-
сили в ячейки экспериментальной планше- нии значительного снижения КОЕ P. acnes.
22 Научный отделЕ.С. Тучина, В.В. Тучин, Г.Б. Альтшулер, И.В. Ярославский. Фотодинамическое воздей-
ствие
120 120
100 100
80 80
КОЕ, %
КОЕ, %
60 60
40 40
20 20
0 0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Концентрация, % Концентрация, %
а б
Рис. 1. Влияние различных концентраций красителей в темноте (●) и при облучении (♦) на колониеобразующую способ-
ность P. acnes: а – обработка метиленовым синим; б – обработка индоцианином зеленым. Воздействовали красным 625 нм
и инфракрасным 805 нм излучением в течение 5 мин
120 120
100 100
80 80
КОЕ, %
КОЕ, %
60 60
40 40
20 20
0 0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
Время преинкубации, мин Время преинкубации, мин
а б
Рис. 2. Зависимость выживаемости бактерий P. acnes от длительности преинкубации с красителями в темноте (●) и при
облучении (♦): а – с 0.025% метиленовым синим; б – с 0.1% индоцианином зеленым. Воздействовали красным 625 нм и
инфракрасным 805 нм излучением в течение 5 мин
Физика 23Известия Саратовского университета. 2008. Т. 8. Сер. Физика, вып. 1
Использование красного излучения клеток ИЗ в лосьоне на основе глицерина и
(625 нм) при фотовоздействии на P. acnes спирта с последующим действием красного
было достаточно эффективным. Снижение излучения приводила к уменьшению показа-
числа КОЕ происходило после 5 мин облу- теля КОЕ на 58% после 5 мин облучения, на
чения на 33%, после 10 мин – на 20%, после 79% − после 10 мин, на 63% − после 15 мин,
15 мин – на 34%, после 30 мин – на 51%. на 64% − после 30 мин (рис. 4).
Применение водного раствора МС в качестве
фотосенсибилизатора обусловливало сниже- 120
ние числа КОЕ под воздействием красного 100
излучения в течение 5 мин на 50%, в течение
80
10 мин − на 40%, в течение 15 мин − на 42%,
КОЕ, %
в течение 30 мин − на 100%. Обработка бак- 60
териальных клеток МС в лосьоне на основе 40
глицерина и спирта с последующим действи-
20
ем красного излучения приводило к умень-
шению показателя КОЕ на 60% после 5 мин 0
облучения, на 58% − после 10 мин, на 95% − 0 5 10 15 30
Время, мин
после 15 мин, на 100% − после 30 мин (рис. 3).
Рис. 4. Действие инфракрасного излучения (805 нм)
на выживаемость P. acnes: ■ − инфракрасное излу-
120
чение, ■ − излучение и водный раствор красителя,
100 □ − излучение и раствор красителя в лосьоне
80
КОЕ, %
60 3. Обсуждение
40 Патогенез угревой сыпи пока недоста-
точно изучен. По всей видимости, этот про-
20
цесс обусловлен множеством факторов, в
0 том числе уровнем выделения кожного сала
0 5 10 15 30 и частотой образования микрокамедонов. P.
Время, мин
acnes превращает триглицериды сала, изна-
Рис. 3. Действие красного излучение (625 нм)
чально обладающие противомикробными
на выживаемость P. acnes: ■ − красное излучение,
свойствами, в безвредные для микроорга-
■ − излучение и водный раствор красителя, низмов жирные кислоты, что приводит к ак-
□ − излучение и раствор красителя в лосьоне
тивному развитию транзиторных микроорга-
низмов. Бактериальные метаболиты служат
Воздействие лазерным излучением с дли- хемоаттрактантами для лейкоцитов макроор-
ной волны 805 нм на P. acnes в течение 5 мин ганизма. Известно, что данные клетки игра-
стимулировало размножение клеток данного ют большую роль в формировании очага
микроорганизма, увеличение числа КОЕ от- воспаления и иммунном ответе, в результате
носительно контроля составило 10%. Значе- их деятельности и происходит образование
ние КОЕ не отличалось от контрольного по- камедонов [10].
сле 10 мин воздействия инфракрасного излу- Использование красного излучения для
чения. Сокращение числа КОЕ под действи- фотодинамической терапии угревой сыпи
ем облучения происходило после 15 мин – на является весьма эффективным. Рядом авто-
60%, после 30 мин – на 53%. Применение вод- ров показано, что применение красного све-
ного раствора ИЗ в качестве фотосенсибили- тодиодного (660 нм) и лазерного излучения
затора обусловливало снижение числа КОЕ (805 нм) в сочетании с соответствующими
под воздействием инфракрасного излучения фотосенсибилизаторами или синим (415 нм)
в течение 5 мин на 24%, в течение 10 мин − излучением сокращает количество воспален-
на 62%, в течение 15 мин − на 80%, в течение ных угрей на коже пациента, приводит к ус-
30 мин − на 90%. Обработка бактериальных коренному их заживлению [3, 8, 9], в процес-
24 Научный отделЕ.С. Тучина, В.В. Тучин, Г.Б. Альтшулер, И.В. Ярославский. Фотодинамическое воздей-
ствие
се светолечения происходит повышение сек- излучения на несенсибилизированные бакте-
реции цитокинов фагоцитами, что стимули- рии (см. рис. 3). Хорошо видно, что увеличе-
рует пролиферацию фибробластов кожи, ние времени облучения от 5 до 30 мин при-
влечет за собой снижение продукции кожно- водит сначала к некоторому снижению КОЕ,
го сала и способствует более быстрому об- затем к его повышению и опять к некоторо-
новлению эпидермиса [10]. му снижению. Явно видно, что происходит
Лазерная и световая терапия с длинами конкуренция нескольких разнонаправленных
волн 400–700 нм находит терапевтическое процессов. Это, во-первых, подавляющее
обоснование ввиду фотохимических особен- действие кислорода и возбужденных порфи-
ностей молекул порфиринов – эндогенных ринов, а во-вторых, процесс биостимуляции
красителей в клетках P. acnes. Наиболее эф- (более эффективного размножения бактерий)
фективно порфирины поглощают свет с дли- под действием света, который хорошо извес-
нами волн 400−420 нм, что соответствует так тен [12]. Важно, что даже действие разведен-
называемой полосе Соре. Но существуют и ного в воде фотосенсибилизатора МС, кото-
Q-полосы менее эффективно поглощающие рый менее эффективен, чем он же при разве-
излучение с длинами волн 500−700 нм. По- дении в глицерино-спиртовом лосьоне, с
добное воздействие приводит к образованию действием кислорода не могут противостоять
порфиринами активных радикалов, которые биостимуляции. И только к 30-й мин наблю-
незамедлительно вызывают разрушение бак- дается резкое уменьшение КОЕ.
териальной клетки [11]. При недостаточном Мы также впервые в этой работе обна-
содержании эндогенных порфиринов роль ружили биостимулирующее действие ИК
сенсибилизаторов успешно выполняют соот- излучения (805 нм) на бактерии (см. рис. 4),
ветствующие экзогенные красители [8, 9]. которое компенсируется действием кислоро-
Полученные данные об эффективном да только к 10-й мин облучения. При этом
подавлении размножения бактерий P. acnes, к 10-й мине мы имеем довольно сильное
обработанных фотосенсибилизаторами, под снижение числа КОЕ для обоих растворов
действием красного (625 нм) и инфракрасно- фотосенсибилизатора при разведении ИЗ в
го (805 нм) излучения, скорее всего, связаны воде и глицерино-спиртовом лосьоне. При
с многофакторным воздействием в условиях этом лосьон оказывается более эффективным
эксперимента, которые в значительной сте- растворителем.
пени соответствуют условиям световой тера- Как было показано ранее [8, 9, 13], гли-
пии угревой сыпи. А именно в технологии церино-спиртовой раствор способствует бо-
лечения предварительно производится кос- лее эффективному прокрашиванию биотка-
метическая чистка кожи, что влечет за собой ней за счет увеличения проницаемости мем-
более эффективное снабжение тканей саль- бран клеток, а также способствует более ста-
ной железы, где развиваются бактерии, ки- бильному и сильному поглощению света мо-
слородом воздуха. лекулами фотосенсибилизатора, что в целом
Наши эксперименты в той части, где соответствует результатам настоящей рабо-
идет облучение светом, проводились на от- ты, но уже при исследованиях на микроорга-
крытом воздухе, поэтому кислородный фак- низмах.
тор в некотором подавлении микробной Некоторая противоречивость результа-
флоры должен быть учтен при интерпрета- тов для ИК излучения при времени облуче-
ции результатов. С одной стороны, из наших ния более 15 мин, когда более эффективным
экспериментов следует, что при используе- оказывается водный раствор, а в глицерино-
мых длительностях облучения на воздухе спиртовом растворе начинается даже относи-
(5−30 мин) кислородный фактор не является тельный рост числа КОЕ, требует дальней-
определяющим, тем не менее он может не- шего исследования. Возможно, что при срав-
сколько модифицировать отклик бактерий. нительно длительном действии света проис-
Интересно в этом смысле проследить за по- ходит модификация самих растворов, кото-
ведением бактерий при воздействии красного рая изменяет условия подавления роста бак-
Физика 25Известия Саратовского университета. 2008. Т. 8. Сер. Физика, вып. 1
терий. Тем не менее по результатам наших 6. Kawada A., Aragane Y., Sangen Y., Tezuka T. Acne photo-
therapy with a high-intensity, enhanced, narrow-band, blue
исследований для ИК излучения можно сде- light source: an open study and in vitro investigation // J. Der-
лать важный практический вывод: время об- matol. Sci. 2002. Vol.30. P.129−135.
лучения при выбранной плотности мощности 7. Hongcharu W., Taylor C.R., Chang Y. D. Topical ALA-
50 мВт/см2 не должно превышать 10 мин при photodynamic therapy for the treatment of acne vulgaris //
использовании глицерино-спиртового рас- J. Invest Dermatol. 2000. Vol.115. P.183−192.
творителя. 8. Tuchin V.V., Genina E.A., Bashkatov A.N., Simonenko G.V.,
Odoevskaya O.D. , Altshuler G.B. A pilot study of ICG laser
Авторы выражают признательность therapy of acne vulgaris: Photodynamic and photothermolysis
Л.Е. Долотову за разработку светодиодного treatment // J. Lasers in Surg. and Med. 2003. Vol.33, №5.
облучателя и помощь при проведении P.296−310.
экспериментов. 9. Genina E.A., Bashkatov A.N., Simonenko G.V., Odoev-
skaya O.D., Tuchin V.V., Altshuler G.B. Low-Intensity ICG-
Представленные результаты получены Laser Phototherapy of Acne Vulgaris: A Pilot Study // J. Bio-
в ходе работ по гранту CRDF RUB1-570-SA-04 med. Opt. 2004. Vol.9, №4. P.828−834.
при финансовой поддержке Palomar Medical 10. Анфимова Н.А., Потекаев Н.Н., Ткаченко С.Б., Шуги-
Technologies, Burlington, USA. нина Е.А. Фотодинамическая терапия: патогенетическое
обоснование эффективности при вульгарных угрях // Экс-
Библиографический список перим. и клин. дерматокосметология. 2005. №5.
С.125−130.
1. Ross E.V. Acne, Lasers and Light // Advances in Dermatol-
ogy. 2005. Vol.21. P.1−32. 11. Mariwalla K., Rohrer T. Use of lasers and light-based
therapies for treatment of acne vulgaris // J. Lasers in Surg.
2. Nitzan Y., Dror R., Ladan H., Malik Z., Kimel S., Gottfried V. and Med. 2005. Vol.37. P.333−342.
Structure-activity relationship of porphyrines for photoin-
activation of bacteria // Photochem. Photobiol. 1995. Vol.62. 12. Ovchinnikov I.S., Shoub G.M., Tuchin V.V. Photodynamic
P.342–347. effect of laser radiation and methylene blue on some opportun-
istic pathogenic microorganisms of oral cavity // Proc. SPIE.
3. Papageorgiou P., Katsambas A., Chu A.. Phototherapy with 2000. Vol.4001. P.390−392.
blue (415 nm) and red (660 nm) light in the treatment of acne
vulgaris // British. J. Dermatol. 2000. №142. P.973–978. 13. Genina E.A., Bashkatov A.N., Sinichkin Yu.P., Kochubey V.I.,
Lakodina N.A., Altshuler G.B., Tuchin V.V. In vitro and in vivo
4. Kjeldstad B., Johnsson A. An action spectrum for blue and study of dye diffusion into the human skin and hair follicles //
near ultraviolet inactivation of Propionibacterium acnes: with J. Biomed. Opt. 2002. Vol.7. P.471−477.
emphasis on a possible porphyrin photosensitization // Photo-
chem. Photobiol. 1986. Vol.43. P.67–70.
5. Simpson N. Antibiotics in acne: time for a rethink // British.
J. Dermatol. 2001. №144. P.225−227.
26 Научный отделВы также можете почитать
