Новые высокоэффективные маркеры рака мочевого пузыря

Учреждение Российской академии наук
                          Институт
                   биоорганической химии
  им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ)

Новые высокоэффективные маркеры
      рака мочевого пузыря

 Буздин Антон Александрович,
 старший научный сотрудник, доктор биологических наук

Главные объекты
           исследования:

-Маркеры – белок-кодирующие гены

-Маркеры - микроРНК

Работа ведѐтся совместно с Московским Научно-
Исследовательским Онкологическим Институтом им.
П.А.Герцена
и Факультетом фундаментальной медицины МГУ им.
М.В.Ломоносова

Рак мочевого пузыря (Bladder cancer):
- Около 6% от всех регистрируемых случаев рака; ежегодно
умирает около 145 тыс. человек

Формы РМП:
 90% Переходно-клеточный рак (Urothelial cell carcinoma) (из
переходноклеточного эпителия мочевыводящих путей)
4% Плоскоклеточный рак (Squamos cell carcinoma) (из клеток
шиповатого слоя)
1-2% Аденокарцинома МП (из клеток железистой ткани)

                          0 – опухоли in situ (практически не
                          метастазирует);
                          1-2 – поверхностный рак
                          (метастазирует редко);
                          3-4 – инвазия в мышечный слой и
                          окружающие ткани (высокая
                          степень метастазирования).

Рак мочевого пузыря:
Причины заболевания неизвестны, но выявлены
факторы наибольшего риска заболевания:

Курение;
Преклонный возраст (65-85 лет);
Работа в производстве текстиля, красителей, в печатном
производстве, нефтяной промышленности;
Мужской пол;
Белая раса;
Наследственный фактор;
Хронические инфекционные заболевания мочевого пузыря;
Применение химиотерапевтических препаратов;
Радиационное облучение органов таза;
Врожденные дефекты мочевого пузыря;
Наличие камней в почках на протяжении нескольких лет;
Воздействие нитрозаминов, бензидинов, некоторых других
хим. соединений, мышьяка.

   По данным Global Cancer Statistics, ранняя диагностика РМП существенно
    повышает шансы на успех проводимой терапии и даѐт возможность полного
    излечения пациентов

   Большинство опухолей мочевого пузыря диагносцируется уже на поздних стадиях
    (≥T2) при наличии их инвазии в мышечный слой и окружающие ткани, что
    значительно уменьшает шансы успеха терапии

   Диагностика РМП требует обязательного инвазивного вмешательства
    (цистоскопии). Это связано с дискомфортом для пациента и риском возникновения
    побочных эффектов

   На сегодняшний день в практике российских клиник практически не используются
    методы молекулярной диагностики и не проводится скрининг групп населения,
    входящих в группу риска возникновения РМП, с целью ранней диагностики или
    выявления предрасположенности к нему

   Современные бесконтактные методы диагностики РМП имеют недостаточную
    чувствительность и специфичность и не пользуются доверием врачей-клиницистов

   -> Необходима разработка высокочувствительной
    диагностической системы, не требующей инвазивного
    вмешательства и одновременно легко применимой в
    обычной клинической лаборатории

Задача :
  - Создать эффективные маркѐры прогрессии РМП

Для этого:

А) В результате анализа литературных источников, мы создали
наиболее полную на сегодняшний день базу данных по генам,
вовлечѐнным в развитие РМП , а также в формирование мочевого
пузыря в ходе эмбриогенеза

Б) Проведено сравнение транскриптомов образцов РМП и
нормальной ткани методами глубокого секвенирования и
гибридизации на микрочипах

В) Экспрессия дифференциальных генов в РМП и норме
исследована методом ОТ-ПЦР в реальном времени

Г) Методом глубокого секвенирования, проведено тотальное
сравнение пулов микроРНК нормальных и раковых тканей мочевого
пузыря

А) В результате анализа литературных источников, создана
наиболее полная на сегодняшний день база данных по генам,
вовлечѐнным в развитие РМП , а также в формирование мочевого
пузыря в ходе эмбриогенеза

(Всего 129 генов и 59 случаев сопряжѐнных геномных перестроек)

Б) Проводится сравнение транскриптомов образцов РМП и
          нормальной ткани методами вычитающей гибридизации и
                        гибридизации на микрочипах

   Интегральный подход основан на
    одновременном всестороннем анализе
    молекулярно-генетических изменений,
    происходящих во время процесса
    опухолеобразования

   Поиск транскриптомных различий РМП и
    нормы осуществляется с помощью
    нескольких методов:

•   Анализа экспрессии генов на микрочипах
    (Illumina HT 12 v.3; около 45 тыс. генов и
    различных вариантов транскриптов)

•   Вычитающей гибридизации (Suppression
    subtractive hybridization) c последующим
    глубоким секвенированием
    дифференциальных библиотек (в нашем
    случае – около )

•   Количественной ОТ-ПЦР

•   Анализа пулов коротких РНК и их
    экспрессии

Обнаружение новых потенциальных маркѐров РМП

                Результаты:
   график

Обнаружение новых микроРНК - маркѐров РМП

 Почему микроРНК? –стабильны в физиологических жидкостях

Всего обнаружено:

-489 ранее неизвестных микроРНК, высокопредставленных в ткани
уротелия, из них 57 являются потенциальными маркѐрами РМП

-309 известных микроРНК, высокопредставленных в ткани уротелия, из
них 44 являются потенциальными маркѐрами РМП

Как детектировать микроРНК?

                                            Применение метода поверхностного плазмонного
                                            резонанса позволяет детектировать фемто- и
                                            аттомолярные концентрации микроРНК в реальном
                                            времени в формате микрочипов

                                            -Подходит для неинвазивного мониторинга

Коллектив группы:
Анастасия Заболотнева, Елена Гогвадзе, Елена Александрова, Андрей Гаража,
Мария Сунцова, Галина Малахова, Антон Буздин

Научное сотрудничество:
Факультет фундаментальной медицины МГУ Н.М. Гайфуллин
МНИОИ им. П.А.Герцена П.А. Шегай, Д.Г. Соков, И.Г. Русаков, Б.Я.Алексеев
University of Lethbridge (Canada) Jody Filkowsky, Olga Kovalchuk
California Institute of Technology (USA) Alex Aravin

Патенты РФ (Роспатент):

1) Патент РФ по заявке: «Способ получения биосенсоров (варианты)» № 2004100874, Авторы - Буздин А.А., Георгиев Г.П., Ковальчук М.В.,
Кутьин Н.Г., Свердлов Е.Д., Сорокин В.Ф., Ярыгин В.Н.
2) Промотор для тканеспецифической экспрессии генов в герминальных тканях млекопитающих. Буздин А.А., Гогвадзе Е.В., Кузьмин
Д.В., Холоденко Р.В.
3) Средство для генной терапии злокачественных опухолей.
   Буздин А.А., Гогвадзе Е.В., Кузьмин Д.В., Холоденко Р.В.

Патентные заявки 2011года:

1)« Способ диагностики рака мочевого пузыря (варианты) и набор для его осуществления» Авторы: Заболотнева A.A. (RU), Шегай П.В. (RU),
Гайфуллин Н.М. (RU), Русаков И.Г. (RU), Буздин А.A. (RU).
                                                         2011, Патентная заявка 2011103094, подана от организации Учреждение Российской
академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

2) « Способ диагностики рака мочевого пузыря с помощью онкомаркера KIFC1 (варианты) и набор для его осуществления» Авторы: Заболотнева
A.A. (RU), Шегай П.В. (RU), Гайфуллин Н.М. (RU), Русаков И.Г. (RU), Буздин А.A. (RU).
                                                                                     2011, Патентная заявка 2011109883, подана от организации
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

3) « Способ диагностики рака мочевого пузыря с помощью онкомаркера ATP6V1C1 (варианты) и набор для его осуществления» Авторы:
Заболотнева A.A. (RU), Шегай П.В. (RU), Гайфуллин Н.М. (RU), Русаков И.Г. (RU), Буздин А.A. (RU).2011, Патентная заявка 2011109882, подана от
организации Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

4) « Способ диагностики рака мочевого пузыря с помощью онкомаркера NUSAP1 (варианты) и набор для его осуществления» Авторы:
Заболотнева A.A. (RU), Шегай П.В. (RU), Гайфуллин Н.М. (RU), Русаков И.Г. (RU), Буздин А.A. (RU).2011, Патентная заявка 2011109878, подана от
организации Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

5) « Способ диагностики рака мочевого пузыря с помощью онкомаркера PRC1 (варианты) и набор для его осуществления» Авторы: Заболотнева
A.A. (RU), Шегай П.В. (RU), Гайфуллин Н.М. (RU), Русаков И.Г. (RU), Буздин А.A. (RU).
                                                                                     2011, Патентная заявка 2011109879, подана от организации
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

6) « Способ диагностики рака мочевого пузыря с помощью онкомаркера UBE2C (варианты) и набор для его осуществления» Авторы: Заболотнева
A.A. (RU), Шегай П.В. (RU), Гайфуллин Н.М. (RU), Русаков И.Г. (RU), Буздин А.A. (RU).
                                                                                     2011, Патентная заявка 2011109880, подана от организации
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

7) « Способ диагностики рака мочевого пузыря с помощью онкомаркера TFDP1 (варианты) и набор для его осуществления» Авторы: Заболотнева
A.A. (RU), Шегай П.В. (RU), Гайфуллин Н.М. (RU), Русаков И.Г. (RU), Буздин А.A. (RU).
                                                                                     2011, Патентная заявка 2011109881, подана от организации
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН